膽堿激酶α促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展及藥物抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:膽堿激酶α促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的機(jī)制研究
　　研究背景和目的:
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)的主要組織學(xué)類(lèi)型，在世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)惡性腫瘤當(dāng)中位居第六位，其病死率在腫瘤相關(guān)死亡中排名第三位。盡管近年來(lái)針對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷和治療有了很大的進(jìn)步，然而總體來(lái)說(shuō)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后仍然不不理想，大部分的肝細(xì)胞癌患者被確診時(shí)已處

2、于癌癥晚期，缺乏有效的治療手段，而肝細(xì)胞癌患者也主要死于癌癥進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生的腫瘤侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。包括中國(guó)在內(nèi)的世界多個(gè)國(guó)家針對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，取得了一定的發(fā)現(xiàn)和成果，然而肝細(xì)胞癌進(jìn)展的分子機(jī)制至今仍未系統(tǒng)性闡明。因此，深入研究肝癌進(jìn)展中腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)更加有效的治療手段仍然是肝細(xì)胞癌研究的重點(diǎn)。
　　膽堿激酶(Choline Kinase)是膽堿代謝通路(Choli

3、ne Pathway)第一步的反應(yīng)酶，主要催化由膽堿生成磷酸膽堿的轉(zhuǎn)化過(guò)程。近年來(lái)，膽堿激酶α(Choline Kinase Alpha，CHKA)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物曾被報(bào)道在多種惡性腫瘤當(dāng)中表達(dá)顯著上調(diào)，并可以作為患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志，更有許多研究報(bào)道CHKA具有癌基因的特征。而本課題組的前期研究當(dāng)中，運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者的癌組織中存在CHKA的拷貝數(shù)擴(kuò)增并進(jìn)行了驗(yàn)證;通過(guò)擴(kuò)大臨床樣本量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CHKA在肝細(xì)胞癌組織中

4、呈現(xiàn)普遍的高表達(dá)，并與肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良相關(guān);此外，還通過(guò)了一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)高表達(dá)CHKA可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;在初步的機(jī)制探索中我們發(fā)現(xiàn)了CHKA是通過(guò)激活A(yù)KT通路從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。而CHKA如何在肝癌細(xì)胞中激活A(yù)KT通路，其具體的分子機(jī)制是怎樣的目前尚不清晰，國(guó)內(nèi)外也暫無(wú)系統(tǒng)的報(bào)道。
　　本課題旨在深入研究膽堿激酶α(CHKA)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，尋找關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)分子，為肝細(xì)胞

5、癌的治療提供潛在的有效治療靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1、運(yùn)用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建CHKA的過(guò)表達(dá)及干擾肝癌細(xì)胞系及其相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞系;
　　2、應(yīng)用EGF、HGF等細(xì)胞因子刺激結(jié)合抑制劑和siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，研究CHKA對(duì)AKT信號(hào)通路的影響;
　　3、應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)信號(hào)通路蛋白、磷酸化蛋白水平的變化，應(yīng)用 Transwell小室遷移及Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)研究信號(hào)通路的變化對(duì)肝癌細(xì)

6、胞遷移、侵襲能力的影響;
　　4、應(yīng)用免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)和免疫熒光(Immunofluorescence，IF)實(shí)驗(yàn)研究CHKA與表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)及mTOR復(fù)合體2(mTOR complex2，mTORC2)之間的蛋白質(zhì)相互作用和共定位關(guān)系;
　　5、應(yīng)用ELISA檢測(cè)膽堿代謝相關(guān)產(chǎn)物，應(yīng)用CHKA的酶活性抑

7、制劑研究膽堿代謝與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;
　　6、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法（Immunohistochemistry，IHC）研究臨床肝細(xì)胞癌樣本中CHKA與p-AKT(Ser473)水平的相關(guān)性，并結(jié)合臨床隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，研究CHKA聯(lián)合p-AKT(Ser473)對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的判斷的價(jià)值。
　　研究結(jié)果:
　　1、CHKA可以與EGFR發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)EGFR的自磷酸化、二聚化以及減少其在E

8、GF刺激下的內(nèi)化降解;
　　2、CHKA通過(guò)整合EGFR-mTORC2-AKT(Ser473)信號(hào)通路軸促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;
　　3、CHKA促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移并不依賴(lài)于PI3K(P85)以及PDK1介導(dǎo)的AKT在Thr308位點(diǎn)的磷酸化;
　　4、CHKA可以作為EGFR與mTORC2(RICTOR)之間的接頭分子，介導(dǎo)EGFR與mTORC2之間發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，增強(qiáng)mTORC2的激酶活性;
　　5

9、、CHKA可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中的膽堿代謝產(chǎn)物如磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)及磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)的生成，使用CHKA的酶活性抑制劑CK37可以抑制PC及PA的生成，但不能有效抑制CHKA誘導(dǎo)的AKT(Ser473)的磷酸化及肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移;
　　6、CHKA蛋白水平與p-AKT(Ser473)水平在臨床肝細(xì)胞癌樣本中呈現(xiàn)正相關(guān)，兩者聯(lián)合能夠更加有效地預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的

10、預(yù)后。
　　7、在HCC中發(fā)生拷貝數(shù)擴(kuò)增的染色體11q13區(qū)段的基因中，CHKA在多個(gè)公共HCC數(shù)據(jù)庫(kù)中呈現(xiàn)癌組織中的高表達(dá)，與HCC具有高度相關(guān)性，并且在這些基因中干擾CHKA可以顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CHKA可以與EGFR蛋白質(zhì)相互作用，激活EGFR自磷酸化、二聚化并減少其內(nèi)化降解，同時(shí)CHKA還作為EGFR與mTORC2之間的接頭蛋白，介導(dǎo)EGFR與mTORC2發(fā)生蛋白

11、質(zhì)相互作用，形成EGFR/CHKA/mTORC2復(fù)合體，增強(qiáng)mTORC2的激酶活性，最終導(dǎo)致AKT的Ser473位點(diǎn)磷酸化使AKT過(guò)度激活。CHKA促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移主要是通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用，整合并激活上述EGFR-mTORC2-AKT(Ser473)信號(hào)軸而實(shí)現(xiàn)，并不依賴(lài)于經(jīng)典的PI3K-PDK1-AKT(Thr308)通路。此外，CHKA可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中PC及PA等代謝產(chǎn)物生成，但使用CHKA酶活性抑制劑并不能有效抑制CHK

12、A誘導(dǎo)的AKT(Ser473)磷酸化及肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示CHKA其分子本身在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中起的作用比其酶活性更重要。臨床樣本中CHKA的表達(dá)與p-AKT(Ser473)正相關(guān)，兩者聯(lián)合能夠更有效預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后情況。最后，在HCC組織中發(fā)生拷貝數(shù)擴(kuò)增的染色體11q13區(qū)段的基因中，CHKA可能促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。
　　第二部分:膽堿激酶α在EGFR靶向治療肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究
　　研究背景和目的:

13、　　表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是酪氨酸激酶型受體(Receptor Tyrosine Kinase，RTKs)的典型代表，該受體與其配體如表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）結(jié)合活化后，能夠通過(guò)激活下游信號(hào)通路如PI3K/AKT通路、MEK/ERK通路等促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，以及促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用

14、，因而成為了良好的治療靶點(diǎn)。EGFR靶向藥物主要包括受體特異性酪氨酸激酶活性抑制劑如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)，以及單克隆抗體如西妥昔單抗(Cetuximab)等，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌的治療中得到了廣泛的應(yīng)用并收到了良好的療效。
　　文獻(xiàn)報(bào)道約有40％-70％肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)患者的癌組織中存在EGFR過(guò)表達(dá)，并且異?；罨腅GF信

15、號(hào)通路也被報(bào)道在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要促進(jìn)作用，一些研究者也通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGFR靶向藥物可抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，因而EGFR靶向治療曾被認(rèn)為在肝細(xì)胞癌的治療中有良好的應(yīng)用前景。然而不幸的是，在臨床試驗(yàn)當(dāng)中，應(yīng)用EGFR靶向藥物治療肝細(xì)胞癌效果卻不盡如人意。其相應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
　　在本課題組的前期研究當(dāng)中，我們發(fā)現(xiàn)了膽堿激酶α(Choline Kinase Alpha，CHKA)在肝細(xì)胞癌組

16、織中存在高頻高表達(dá)，并且CHKA可以作為接頭蛋白介導(dǎo)EGFR與mTOR復(fù)合體2(mTOR Complex2，mTORC2)之間發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，激活mTORC2的酶活性過(guò)度活化下游AKT從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。而肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的CHKA以及其激活的異常信號(hào)通路是否參與了肝癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向治療藥物的抵抗，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　本研究旨在深入研究CHKA在肝細(xì)胞癌EGFR靶向治療中的作用及其相應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制，

17、為臨床中應(yīng)用EGFR靶向藥物治療肝細(xì)胞癌提供分子標(biāo)志，以及潛在的有效治療策略。
　　研究方法:
　　1、應(yīng)用CCK8短程細(xì)胞增殖/存活藥物抑制實(shí)驗(yàn)研究差異表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞系對(duì)EGFR靶向藥物吉非替尼(Gefitinib)以及厄洛替尼(Erlotinib)治療的敏感性，并運(yùn)用非線(xiàn)性回歸計(jì)算量效關(guān)系曲線(xiàn)以及藥物對(duì)細(xì)胞的50％抑制濃度(50％inhibitory concentration，IC50);
　　2、應(yīng)用長(zhǎng)

18、程克隆形成(Colony Formation Assay)藥物抑制實(shí)驗(yàn)研究高低表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向藥物吉非替尼、厄洛替尼的反應(yīng)性;
　　3、應(yīng)用Western-blot檢測(cè)經(jīng)EGFR靶向藥物處理后，高低表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞中信號(hào)通路分子以及凋亡分子的變化;
　　4、應(yīng)用小鼠皮下荷瘤藥物抑制實(shí)驗(yàn)研究高低表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)EGFR靶向藥物治療的反應(yīng)，應(yīng)用western-blot及免疫組織化學(xué)染色（I

19、mmunohistochemistry，IHC）檢測(cè)荷瘤標(biāo)本中AKT等信號(hào)通路分子的水平及增殖、凋亡標(biāo)志物的水平。
　　研究結(jié)果:
　　1、高表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞相比低表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞在體外對(duì)EGFR靶向藥物如吉非替尼和厄洛替尼的治療相對(duì)不敏感，在EGFR靶向藥物的處理下仍有較高的存活及克隆形成能力;
　　2、在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CHKA可以便肝癌細(xì)胞在體外對(duì)EGFR靶向藥物吉非替尼和厄洛替尼的治療發(fā)生抵抗，而干

20、擾CHKA可以增加肝癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向藥物的敏感性;
　　3、在小鼠皮下荷瘤模型中，過(guò)表達(dá)CHKA可使肝癌細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)EGFR靶向藥物厄洛替尼的治療發(fā)生抵抗，其荷瘤生長(zhǎng)相比對(duì)照組無(wú)法被厄洛替尼抑制。
　　4、高表達(dá)CHKA介導(dǎo)的EGFR與mTORC2相互作用導(dǎo)致AKT通路的異?；罨瘏⑴c了肝癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向藥物治療的抵抗，干擾mTORC2的核心成分RICTOR可以使高表達(dá)CHKA的肝癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶向藥物的治療變得敏感