Id2在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化中的作用及受fyn-Olig1-2信號通路調(diào)節(jié)介導(dǎo)髓鞘再生機制的初步探討.pdf

1、隨著我國老齡化人口的急劇增多，中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病發(fā)生率迅速增高。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，脫髓鞘疾病發(fā)生后促進(jìn)髓鞘再生有賴于對少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化和髓鞘形成機制的進(jìn)一步研究，這一過程受生長因子、激素、胞外基質(zhì)相關(guān)分子等多種因素的調(diào)控，胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sox10、SCIP、Krox24以及大量含螺旋-環(huán)-螺旋(helix-100p-helix,HLH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)揮了重要作用。HLH蛋白可分為兩類：堿性螺旋-環(huán)-螺

2、旋(basichelix-loop-helix，bHLH)和DNA結(jié)合抑制物(inhibitorofDNAbinding，Id)。 觀察Id2在扣帶少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化中的表達(dá)模式有助于了解Id2在扣帶少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化和髓鞘形成中發(fā)揮怎樣的作用?因此，我們觀察了Id2在發(fā)育不同時期扣帶內(nèi)的表達(dá)模式。溴化乙錠(EB)局部注射的脫髓鞘后髓鞘再生的模型內(nèi)有少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化形成髓鞘的現(xiàn)象，觀察Id2在脫髓鞘模型中的表達(dá)變化有

3、助于弄清Id2是否參與了少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化和髓鞘形成的過程。那么Id2在扣帶區(qū)髓鞘再生的過程中變化如何呢?其調(diào)控髓鞘再生的機制是什么呢? 轉(zhuǎn)錄因子Olig是2000年發(fā)現(xiàn)的一類B型bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，其中Olig1和Olig2與少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化和髓鞘形成密切相關(guān)。Olig1蛋白新生期定位于細(xì)胞核，2周齡大部分移位到了細(xì)胞漿，成年均位于細(xì)胞漿。Olig1蛋白脫髓鞘病變發(fā)生后也出現(xiàn)相似的核漿移位現(xiàn)象：當(dāng)OPCs對損傷發(fā)生應(yīng)

4、答時，可見Olig1蛋白從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞核；當(dāng)髓鞘再生完成后，Olig1蛋白又重新轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿；但是當(dāng)出現(xiàn)髓鞘再生障礙時，大部分OPCs(oligodendrocyteprogenitorcells)中的Olig1蛋白卻定位在細(xì)胞漿。因此Olig1蛋白在髓鞘再生過程中是否發(fā)生核-漿移位，可能是Olig1蛋白參與髓鞘修復(fù)的關(guān)鍵機制。Olig2基因缺失的動物腦中的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞OPCs明顯減少，不能形成正常的少突膠質(zhì)細(xì)胞，在脊髓中甚至完全

5、缺乏OPCs，因而也最終影響了髓鞘的形成；在Olig1和Olig2基因同時缺失時會導(dǎo)致全腦不能形成少突膠質(zhì)細(xì)胞，嚴(yán)重影響髓鞘形成。Olig2主要促進(jìn)OPCs的增殖和向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，而Olig1則主要促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步成熟和形成髓鞘。 Id2可與屬于A型bHLH的E蛋白結(jié)合形成二聚體，阻斷與屬于B型bHLH的轉(zhuǎn)錄因子Olig的結(jié)合，從而負(fù)向調(diào)控Olig的作用。在小鼠側(cè)根神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞分化過程中，研究證實Id2與Olig1和

6、Olig2有共存表達(dá)，且能夠相互結(jié)合，Id2抑制Olig影響了BMP4對神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的抑制。那么在扣帶髓鞘再生的過程中，Id2是否能和Olig1、Olig2結(jié)合從而抑制Olig的作用，進(jìn)而調(diào)控髓鞘再生呢?因而我們在觀察Id2在脫髓鞘模型中的表達(dá)變化的同時，觀察了Id2和Olig1、Olig2的共定位情況。結(jié)果提示Id2可能通過與Olig基因相互作用來介導(dǎo)髓鞘再生。但I(xiàn)d2與Olig基因的相互作用又受其上游的什么因素調(diào)控

7、呢? Fyn是非受體酪氨酸蛋白激酶(protein-tyrosinekinase，PTK)Src家族成員之一，F(xiàn)yn在髓鞘形成起始階段發(fā)揮重要作用。Fyn缺乏小鼠，髓鞘變薄40-50％。Fyn信號通路最后通過激活髓鞘堿性蛋白(MyelinBasicProtein，MBP，為成熟髓鞘的標(biāo)志物之一)基因而在髓鞘形成中發(fā)揮重要作用；而Id2對MBP基因啟動子活性則具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Fyn酪氨酸激酶通過促使酪氨酸磷酸化(包括MAPK/E

8、RK信號通路)發(fā)揮啟動髓鞘形成的作用，而MAPK/ERK信號通路可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Olig2的功能，從而誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞系分化。Fyn磷酸化可能直接或者通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)C/EBP轉(zhuǎn)錄因子，而Id2為C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的直接下游目標(biāo)基因。因此，F(xiàn)yn可能調(diào)節(jié)Olig基因、或者通過調(diào)節(jié)Id2表達(dá)，而Id2通過抑制Olig基因的作用介導(dǎo)髓鞘再生。 因此，本文進(jìn)行了以下幾個方面進(jìn)行研究： (1)運用免疫組化單雙標(biāo)

9、技術(shù)，觀察了Id2在成年大鼠腦內(nèi)的分布有何特征和規(guī)律?即證明了Id2在成年大鼠腦內(nèi)究竟在哪些區(qū)域的表達(dá)最強和可能發(fā)揮重要作用。Id2究竟主要在大鼠大腦內(nèi)哪種類型的細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮功能。以及Id2究竟在大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化中的哪些階段發(fā)揮作用。 (2)觀察了Id2在發(fā)育不同時期扣帶內(nèi)的表達(dá)模式和Id2在EB局部注射脫髓鞘后髓鞘再生的模型中的表達(dá)變化規(guī)律，為研究它參與調(diào)節(jié)髓鞘形成和髓鞘再生的機制奠定基礎(chǔ)。 (3)分析

10、Id2與Olig1/2的表達(dá)變化規(guī)律和胞漿胞核共定位與Fyn表達(dá)變化和髓鞘再生的關(guān)系，利用體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞模型，運用fyn抑制劑，觀察轉(zhuǎn)錄因子Id2、Olig1/2及其相互作用是否與fyn變化有關(guān)。 主要得到如下結(jié)果： 1、Id2在成年大鼠腦內(nèi)的分布特征和規(guī)律： (1)Id2在視交叉、前嗅核、海馬傘、錐體束等部位呈高表達(dá)，在胼胝體和扣帶的表達(dá)最強。 (2)Id2與前庭上核(sv)

11、等神經(jīng)元和小腦蒲肯野神經(jīng)元共表達(dá)，約占整個大腦中Id2陽性細(xì)胞的5％。Id2與皮層、扣帶等區(qū)域內(nèi)GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞有少量共表達(dá)，約占5％。90％的Id2陽性細(xì)胞為少突膠質(zhì)譜系的細(xì)胞。 (3)Id2與Olig1+、Olig24、PDGFaR+少突膠質(zhì)細(xì)胞有少部分共表達(dá)，70％在CC-1+終末分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。Id2在成年大鼠腦內(nèi)可能對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞有部分作用，可能主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞的終末分化和髓鞘形成中發(fā)揮重要作

12、用。 2、Id2在發(fā)育和脫髓鞘扣帶中的表達(dá)變化： (1)Cuprizone喂養(yǎng)大鼠脫髓鞘不明顯，EB注射大鼠扣帶脫髓鞘明顯。 (2)Id2從P0天至成年表達(dá)逐漸增強。Id2在胚胎及出生后2周前，Id2在胞漿中表達(dá)，成年遷移至細(xì)胞核。 (3)Id2的表達(dá)從EB3至EB7即隨髓鞘的脫失表達(dá)逐漸降低，在EB7至EB28即髓鞘再生過程中表達(dá)逐漸增強，且在在成年脫髓鞘10天，部分移位至胞漿中表達(dá)。由于少突膠質(zhì)前體細(xì)

13、胞在出生后逐漸發(fā)育成熟，脫髓鞘模型7天后逐漸再生，Id2在此過中表達(dá)逐漸增強以及Id2在發(fā)育和再生過程中可能存在核漿轉(zhuǎn)位的結(jié)果提示Id2可能在髓鞘的形成和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。 3、(1)Id2在發(fā)育和脫髓鞘扣帶與Olig1的表達(dá)關(guān)系：Id2與Olig1的表達(dá)模式不同，olig1在在正常生后至成年的扣帶內(nèi)表達(dá)均很弱，Id2表達(dá)逐漸增強。Olig1的表達(dá)從EB3、EB7至EB28先增強后減弱，Id2則先減弱后增強。Olig1從

14、P0天至成年逐漸從胞核轉(zhuǎn)位至胞漿，Id2則從胞漿至胞核。Olig1從EB3、EB7至EB28從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核再到胞漿，Id2則從胞核至漿再到胞核。Id2在脫髓鞘7天時，部分在核內(nèi)與Olig1共表達(dá)；脫髓鞘10天，部分在胞漿中與Olig1共表達(dá)。 (2)Olig2在在胞正常生后至成年的扣帶內(nèi)表達(dá)增強，在脫髓鞘扣帶內(nèi)表達(dá)先增高后減弱，Id2和olig2在細(xì)胞核中共存。 (3)fyn的表達(dá)從EB3、EB7至EB28先減弱后增強

15、，與Id2相似，Olig1、Olig2相反。離體實驗顯示，加入1uMfyn抑制劑PP1明顯延遲少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟，Olig1的表達(dá)增強，而Id2的表達(dá)減弱；Olig1在胞漿表達(dá)，Id2轉(zhuǎn)位至胞核中表達(dá)，仍然與Olig1在同一細(xì)胞中。這些結(jié)果提示Id2和Olig1之間可能存在相互作用，且Id2和Olig1表達(dá)變化和它們之間的共定位關(guān)系與Fyn的變化有關(guān)。 綜上所述，本文通過觀察Id2在成年大鼠腦內(nèi)的分布特征和規(guī)律，F(xiàn)yn、I

16、d2、Olig1、Olig2在發(fā)育不同時期和EB注射脫髓鞘模型的扣帶內(nèi)的表達(dá)變化及其它們間的相互作用，進(jìn)一步運用離體模型、fyn抑制劑，觀察Id2、olig、Olig2及其共定位變化是否與fyn有關(guān)。 結(jié)果提示Id2可能與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的早期定向分化和髓鞘形成有關(guān)系，Id2和Olig1之間可能存在相互作用，在Id2和Olig1表達(dá)變化的同時，F(xiàn)yn也發(fā)生表達(dá)變化；而離體實驗進(jìn)一步證明Id2和Olig1表達(dá)變化是與Fyn的變化有