TAK1信號通路在樹突狀細(xì)胞分化、發(fā)育及T1DM發(fā)病過程中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)方法，TAK1信號通路在DC分化、發(fā)育及1型糖尿?。╰ype1 diabetes mellitus，T1DM）發(fā)病過程中的分子作用機(jī)制。通過體外培養(yǎng)骨髓來源的DC，從形態(tài)學(xué)、表型及功能給予鑒定，進(jìn)而建立體外培養(yǎng)DC的方法。通過體外觀察TAK1抑制劑（5z-7-oxozeaenol）對DC形態(tài)學(xué)、凋亡、表型、功能以及蛋白TLR4、TAK1、JNK、AP-1及NF-κB表達(dá)水平的影響；體內(nèi)觀察TAK1抑制劑對T1DM

2、小鼠的治療作用，明確其治療T1DM的作用及可能的分子作用機(jī)制；觀察TAK1抑制劑作用的DC在T1DM小鼠中的作用，從而進(jìn)一步明確TAK1抑制劑是否通過DC在T1DM發(fā)病過程中的發(fā)揮作用。
　　方法：(1)體外分離C57BL/6小鼠的骨髓，制取細(xì)胞懸液，通過加入不同刺激因子如巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白介素-4（Int

3、erleukin-4，IL-4）進(jìn)行干預(yù)，于實(shí)驗(yàn)第7天通過檢測CD11c的表達(dá)觀察不同培養(yǎng)條件下小鼠骨髓源細(xì)胞向DC分化情況及檢測CD86，MHC-Ⅱ的表達(dá)和當(dāng)DC與脾淋巴細(xì)胞比例為1:20時進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)來觀察對DC功能的影響。
　　(2)通過上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的C57BL/6小鼠骨髓源DC，于實(shí)驗(yàn)第6、7天分別加入LPS作用24h及不同劑量的TAK1抑制劑（0.9μg.ml-1、1.8μg.ml-1）作用4h后于顯微鏡下

4、觀察細(xì)胞形態(tài)，收集細(xì)胞，取部分細(xì)胞用于檢測其表面抗原CD11c、MHC-Ⅱ和CD86的陽性表達(dá)率、凋亡情況及檢測TAK1抑制劑對DC刺激同種異體脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響，另取部分細(xì)胞用于檢測其對TLR4、TAK1、JNK、AP-1及NF-κB蛋白表達(dá)的影響。
　　(3)C57BL/6小鼠在SPF環(huán)境中適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，于腹腔連續(xù)5次注射小劑量鏈脲佐菌素（40 mg.kg-1，STZ）溶液，注射完72小時后，測定血糖，小鼠血糖≥16

5、.7 mmol.l-1，即判斷T1DM造模成功。造模成功后將小鼠隨機(jī)分為：正常對照組、模型組、TAK1抑制劑高劑量組（75μg.kg-1）、TAK1抑制劑低劑量組（37.5μg.kg-1）。小鼠于造模當(dāng)天給予相應(yīng)的TAK1抑制劑，每周給藥1次，連續(xù)4周。每周檢測血糖及體重1次。末次給藥后，觀察一段時間，于實(shí)驗(yàn)的第44天將小鼠安樂死，分離脾臟和骨髓，制取淋巴細(xì)胞懸液，檢測小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力及骨髓來源DC表型和功能的影響。取部分胰

6、腺用于HE染色，觀察小鼠胰島β細(xì)胞的炎性浸潤情況。另取部分胰腺和脾臟用于檢測其對TAK1、JN K和N F-κB蛋白表達(dá)的影響。
　　(4)于C57BL/6小鼠造模，造模完成后當(dāng)天給予處理過的DC細(xì)胞，每周檢測血糖及體重1次，實(shí)驗(yàn)的第42天處死小鼠，分離脾臟制取淋巴細(xì)胞懸液，檢測小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力。另取部分胰腺和脾臟用于Wester nblot檢測其對蛋白TAK1、JNK和NF-κB的影響。
　　結(jié)果：(1)GM-

7、CSF能夠促進(jìn)骨髓來源的細(xì)胞向DC分化，IL-4主要能夠影響已分化DC的成熟程度，不能夠促進(jìn)骨髓來源細(xì)胞向DC分化。
　　(2) TAK1抑制劑能夠明顯促進(jìn)DC的凋亡，且其能夠下調(diào)DC表面共刺激分子CD86及MHC-Ⅱ的陽性表達(dá)率，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；其并能夠下調(diào) DC對同種淋巴細(xì)胞增殖的能力。TAK1抑制劑能夠劑量依賴性下調(diào)TLR4、TAK1和N F-κB的表達(dá)，且一定程度的上調(diào)JN K和AP-1的表達(dá)。
　　(3)采用

8、STZ可以建立C57BL/6小鼠T1DM模型，表現(xiàn)為小鼠血糖水平≥16.7 mmol.l-1，多飲，多尿。與模型組相比，給藥組小鼠體重?zé)o明顯變化。與模型組比較，給藥組小鼠血糖水平明顯降低（P<0.05）。在脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，與T1DM模型組相比，TAK1抑制劑顯示出較為明顯的劑量依賴性抑制T淋巴細(xì)胞增殖的作用（P<0.05），對B淋巴細(xì)胞無明顯影響；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示，與T1DM模型組比較，給藥組小鼠DC在20:1的刺激比

9、下可劑量依賴性的降低對同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖作用；FACS結(jié)果顯示，與T1DM模型組比較，給藥組小鼠DC表面抗原刺激分子CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)明顯下降，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。與模型比較，TAK1抑制劑能夠減輕胰島β細(xì)胞的炎性浸潤，且呈現(xiàn)劑量依賴性。與模型組相比，給藥組小鼠體內(nèi)TAK1和NF-κB的表達(dá)明顯降低，JNK的表達(dá)明顯升高。
　　(4)與模型組比較，各DC組小鼠體重?zé)o明顯差異，血糖高于模型組。在脾臟T、B淋巴細(xì)胞增

10、殖實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，給予DC后對T淋巴細(xì)胞增殖明顯增加。在蛋白檢測實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組及DC組小鼠體內(nèi)TAK1、JNK表達(dá)無明顯變化，NF-κB的表達(dá)水平明顯增加。
　　結(jié)論：(1)綜上所述，加入GM-CSF為骨髓來源DC最佳體外培養(yǎng)條件，且為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。
　　(2)TAK1信號通路在DC存活中扮演著重要的角色，TAK1抑制劑能夠通過影響DC的功能及其下游蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用。<