基于MicroRNA的鼻咽癌基因治療初步研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文基于MicrNA的鼻咽癌基因治療初步研究姓名：蔡鑫章申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：趙素萍20070501中南大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要可以通過在經(jīng)典的RNA干擾途徑降解靶基因mRNA、也可以直接抑制靶基因的蛋白翻譯、還可以通過快速脫腺苷化降解mRNA。miRNA已經(jīng)被看作生物體內(nèi)固有的基因調(diào)控子中最大的一個家族。本研究的目的是模擬天然miRNA構(gòu)建表達(dá)miRNA前體的質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因——人端粒

2、酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的表達(dá)，開展對鼻咽癌的基因治療研究。整個研究內(nèi)容分三部分進(jìn)行：第一部分調(diào)控目標(biāo)基因的miRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和有效質(zhì)粒篩選。目的是確定針對hTERT和VEGF基因的miRNA的有效作用位點(diǎn)，觀察構(gòu)建的候選質(zhì)粒對鼻咽癌中兩個靶基因的調(diào)控效應(yīng)，為后續(xù)的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果針對l肥RT和ⅦGF基因分別構(gòu)建了3個質(zhì)粒，每個基因各篩選出了1個有效質(zhì)粒，分別是：pcDNA62GW

3、／EmGFPmiRhT2035、pcDNA62GW／EmGFPmiRV1025；并確定了2035～2055為hTERT的有效作用位點(diǎn)，1025～1045為VEGF基因的有效作用位點(diǎn)；將兩個有效質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞后，應(yīng)用實(shí)時熒光定量RTPCR觀察到miRNA使h1ERT和VEGF基因的mRNA水平分別下調(diào)為773％和793％；應(yīng)用Westernblotting觀察到兩個基因的蛋白表達(dá)分別下調(diào)732％和802％；應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖抑