骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 成體干細(xì)胞移植是治療性血管新生的另一策略。用于移植的細(xì)胞主要包括EPCs、BM-MNCs、PBSCs、MSCs等。目前臨床上最常用的是自體BM-MNCs移植。BM-MNCs中含有EPCs，EPCs可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成新生的血管，在出生后的血管發(fā)生中起重要作用。BM-MNCs還可以分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生。實(shí)驗(yàn)和臨床研究都表明BM-MNCs移植可以改善下肢動(dòng)脈缺血。但是，也有研究顯示干細(xì)胞移植的治療效

2、果和移植細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，而EPCs在骨髓和外周血中的數(shù)量極少，并且在糖尿病、高膽固醇血癥、高胱氨酸血癥、尿毒癥、老齡等病人體內(nèi)EPCs的數(shù)量和功能都較正常人低下。在這些病人中有時(shí)難以采集到足夠的、高質(zhì)量的BM-MNCs而導(dǎo)致治療效果不佳。而骨髓MSCs不僅可以通過(guò)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生，而且可以由體外擴(kuò)增得到大量高質(zhì)量的干細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性，可以進(jìn)行同種異體移植，與BM-MNCs相比，骨髓MSCs有可能會(huì)成為一種

3、更好的治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的移植細(xì)胞來(lái)源。Kinnaird等發(fā)現(xiàn)MSCs促血管新生的效果和其數(shù)量有關(guān)，但是增加MSCs的數(shù)量并不能無(wú)限制的增加MSCs的治療效果。還有研究發(fā)現(xiàn)缺血刺激會(huì)導(dǎo)致移植后的MSCs大量凋亡，數(shù)量銳減，導(dǎo)致其治療效果明顯下降。聯(lián)合其他治療措施以進(jìn)一步增加MSCs的治療效果具有重要的意義。
　　 本課題分三部分，依次探討以下問(wèn)題：(1)評(píng)價(jià)自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的療效并分析其影響因素。

4、(2)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增以及鑒定方法，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及4'，6二脒基-2-苯基吲哚標(biāo)記的效果。(3)制備大鼠下肢缺血模型，研究聯(lián)合應(yīng)用EPO是否可以增強(qiáng)MSCs移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的效果，并且探討其可能的機(jī)制。
　　 第一部分：自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的療效觀察及影響因素分析
　　 目的：評(píng)價(jià)自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的療效并分析其影

5、響因素。
　　 方法：26例符合自體BM-MNCs移植的下肢動(dòng)脈缺血性疾病患者，均于局部麻醉下抽取自體骨髓血，使用密度梯度離心法提取BM-MNCs，行缺血下肢局部肌肉注射。移植術(shù)后3個(gè)月，觀察患肢疼痛、冷感、間歇性跛行距離等變化，進(jìn)行臨床主觀指標(biāo)評(píng)分、測(cè)量踝肱指數(shù)(ankle-brachial index，ABI)、患肢血流速度峰值，與BM-MNCs移植前比較，評(píng)價(jià)BM-MNCs移植治療效果。并且根據(jù)BM-MNCs移植濃度，將患

6、者分為高濃度移植組(大于1×107個(gè)/ml)和低濃度移植組(小于1×107個(gè)/ml)，比較兩組移植前后缺血改善程度，評(píng)價(jià)BM-MNCs移植濃度對(duì)治療效果的影響。
　　 結(jié)果：BM-MNCs移植后3個(gè)月，患者疼痛、冷感、間歇性跛行緩解率分別是92％、84％和88％，各項(xiàng)臨床主觀指標(biāo)評(píng)分明顯低于移植前評(píng)分(P＜0.01)，ABI和患肢血流峰值速度較移植前明顯增加(0.33±0.22 vs0.24±0.17)(P＜0.01)，(26.

7、65+7.31 vs18.32+5.74)(P＜0.05)。高濃度移植組的疼痛、冷感和間歇性跛行臨床主觀指標(biāo)評(píng)分差值明顯大于低濃度組(P＜0.01)，血流峰值速度差值明顯大于低濃度組(5.24±2.34 vs4.39±2.65)(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ABI差值大于低濃度組(0.094±0.093 vs0.078±0.063)，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。隨訪期間所有病人未見(jiàn)明顯并發(fā)癥。
　　 結(jié)論：采用自體BM

8、-MNCs移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病是安全、有效的。BM-MNCs提取的數(shù)量、動(dòng)脈病變的范圍，尤其是BM-MNCs移植濃度對(duì)于其治療效果有重要影響。
　　 第二部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察
　　 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增以及鑒定方法，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及4'，6二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)標(biāo)記的

9、效果。
　　 方法：使用骨髓腔沖洗法采集大鼠骨髓血，通過(guò)密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法得到純化的MSCs，在含有10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)特性、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD29、CD44、CD11b、CD45的表達(dá)，對(duì)培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行鑒定。觀察MSCs的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度、繪制MSCs的生長(zhǎng)曲線、測(cè)定MSCs克隆形成率，凍存復(fù)蘇MSCs后觀察其存活率和生長(zhǎng)狀態(tài)。觀察DAPI標(biāo)記MSC

10、s的效率和對(duì)MSCs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。
　　 結(jié)果：使用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法可以得到高純度的MSCs，MSCs可以通過(guò)體外培養(yǎng)大量擴(kuò)增。通過(guò)本方法培養(yǎng)的MSCs貼壁生長(zhǎng)，呈典型的梭形形狀，漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD11b、CD45表達(dá)陰性，符合MSCs的特征。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)：MSCs呈貼壁生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)9～12d可以達(dá)到90％融合，傳代后的MSCs增殖速度較原代培養(yǎng)明顯增快，第3

11、代的MSCs已基本純化。隨著傳代的增加，體外培養(yǎng)的MSCs生長(zhǎng)增殖能力逐漸減弱，克隆形成率逐漸降低。凍存1個(gè)月和6個(gè)月后復(fù)蘇的MSCs生存率分別為90％和85％，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。DAPI標(biāo)記MSCs的有效率為100％，標(biāo)記48h后熒光顯色無(wú)明顯減弱，DAPI標(biāo)記的MSCs的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法可以有效的獲得純化的MSCs，體外擴(kuò)增MSCs是可行的。凍存對(duì)MSCs生長(zhǎng)特性

12、無(wú)明顯影響。DAPI可以有效的標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，并且對(duì)MSCs的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯影響。
　　 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是近年來(lái)出現(xiàn)的治療嚴(yán)重缺血性疾病的新方法，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)能夠促進(jìn)血管新生和抑制MSCs凋亡，本實(shí)驗(yàn)研究聯(lián)合應(yīng)用E

13、PO是否可以增強(qiáng)MSCs移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的效果，并且探討其可能的機(jī)制。
　　 方法：Wistar大鼠32只，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈及其分支，制備成大鼠下肢動(dòng)脈缺血模型，并隨機(jī)分為四組，每組8只，分別是對(duì)照組、MSC組、EPO組和MSC+EPO組。股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后24h，MSC+EPO組大鼠給予含有MSCs(1×107cells)和EPO(1000U/kg)的DMEM0.4ml注射于患肢缺血肌肉組織中，MSC組大鼠同法注射僅含MS

14、Cs的DMEM，對(duì)照組和EPO組的大鼠僅注射DMEM。
　　 EPO+MSC組和EPO組大鼠于股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后24h開(kāi)始腹部皮下注射含有EPO(1000U/kg·d)的生理鹽水0.4ml，每周前3d注射，每天1次，連續(xù)3周。其他組僅注射生理鹽水。股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后第22d，行激光多譜勒血流灌注成像(laserDoppler perfusion imaging，LDPI)檢查患肢血流灌注恢復(fù)情況、微血管造影檢測(cè)側(cè)枝血管形成情況，抗FVI

15、II因子相關(guān)抗原多克隆抗體、抗αSMA抗體免疫組織化學(xué)染色，顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，檢查血管密度和血管面積。免疫熒光雙染檢查MSCs在體內(nèi)向血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。免疫組織化學(xué)染色檢查Bax、Bcl-2、VEGF在組織中的表達(dá)。RT-PCR檢查VEGF mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：LDPI檢查顯示MSC組和EPO組血流灌注明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.01)，MSC+EPO組最強(qiáng)(P＜0.01)。微血管造影顯示對(duì)

16、照組側(cè)支血管建立最差，MSC組和EPO組較豐富，MSC+EPO組最豐富，MSC組、EPO組和MSC+EPO組造影評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，MSC+EPO組造影評(píng)分最高(P＜0.05)。免疫組化顯示MSC組、EPO組、MSC+EPO組血管密度較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，尤以MSC+EPO組最為顯著(P＜0.05)，大多數(shù)新生的血管是無(wú)血管平滑肌的微血管，其血管面積在各組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。少部分新生血管是有平滑肌

17、的微血管，這部分血管在數(shù)量上各組之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，其血管面積，MSC組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，MSC+EPO組明顯高于MSC組(P＜0.05)，EPO組與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。免疫熒光雙染顯示移植的MSCs可以在體內(nèi)存活，并且分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色和計(jì)算機(jī)圖像分析顯示MSC+EPO組較其他組Bcl-2明顯上調(diào)，Bax明顯下調(diào)，VEGF蛋白表達(dá)更強(qiáng)(P＜0.05)。RT-