畢業(yè)論文小鼠microrna-125b過表達(dá)載體構(gòu)建

1、小鼠micrNA125b過表達(dá)載體構(gòu)建目錄摘要............................................................................................................1Abstract................................................................................

2、......................31前言........................................................................................................42材料與方法...................................................................................

3、.........52.1材料...............................................................................................52.2主要試劑與儀器............................................................................52.2.1主要試劑.............

4、..................................................................52.2.2主要儀器...............................................................................52.3方法...........................................................

5、....................................62.3.1質(zhì)粒提取...............................................................................62.3.2鼠尾基因組DNA提取........................................................62.3.3PCR引物設(shè)計與合成.......

6、...................................................72.3.4PCR擴(kuò)增..............................................................................71摘要NPC1是一種以溶酶體內(nèi)脂質(zhì)異常沉積為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，迄今為止對NPC1的發(fā)病機(jī)制仍得不到合理的解釋。研究發(fā)現(xiàn)miRNA對tau蛋白的調(diào)控

7、和神經(jīng)元存活至關(guān)重要，通過調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶來調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化水平。Tau蛋白過度磷酸化損傷神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)，如過度磷酸化使Tau蛋白結(jié)合微管能力降低[1]，Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)聚積導(dǎo)致神經(jīng)元軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙[2]、乙酰膽堿釋放減少[3]、蛋白酶體活性抑制[47]，這些功能和結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致神經(jīng)元呈慢性進(jìn)行性變性構(gòu)建miR125b表達(dá)載體，從tau蛋白磷酸化調(diào)控的研究入手，系統(tǒng)地研究參與tau蛋白磷酸化調(diào)控的miR125b的

8、靶基因，闡釋其中的分子作用機(jī)制，為tau蛋白異常病變引起的神經(jīng)退行性疾病的研究與防治提供新的思路。本實(shí)驗?zāi)康模罕緦?shí)驗?zāi)康模簶?gòu)建小鼠micrNA125b（miR125b）過表達(dá)載體。方法：方法：參考小鼠miR125b前體序列的PCR擴(kuò)增引物，重新設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為NheI和EcI，PCR擴(kuò)增，然后將目的片段和pcDNA3.1EGFP質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取重組陽性克隆，對重組質(zhì)粒進(jìn)