呼腸孤病毒對乳腺癌干細胞的治療作用.pdf

1、腫瘤干細胞在癌癥中扮演了一個重要角色，因為這些細胞具有增強的形成腫瘤的能力并且對現(xiàn)有的抗癌治療存在抵抗作用。因此，必須找到新癌癥治療方法既能消退腫瘤又能針對腫瘤干細胞從而達到徹底關閉腫瘤細胞的目的。
　　 過去數(shù)年里對溶瘤病毒治療惡性腫瘤的研究越來越多。溶瘤病毒能在易感的腫瘤細胞內增殖，能在腫瘤內或者轉移灶內瞄準、感染并且毀滅殘留的腫瘤細胞，這個過程能自行重復直到被宿主的抗病毒應答反應清除病毒。許多研究顯示呼腸孤病毒3型對人類不

2、致病而且導致人腫瘤細胞的死亡，本課題研究呼腸孤病毒對乳腺癌干細胞的治療作用。
　　 一、NOD/SCID鼠異種原位移植乳腺癌模型的建立
　　 目的：建立NOD/SCID鼠異種原位移植乳腺癌模型并鑒定其生物學特性是否與原發(fā)腫瘤一致。
　　 方法：采用手術中獲得的ER強陽性的乳腺癌患者的腫瘤組織塊移植到NOD/SCID鼠的乳房脂肪墊上。經(jīng)過3次篩選傳代，移植模型趨于穩(wěn)定并進行鑒定。通過HE、TUNEL、DCC和免疫組

3、化等方法，分析乳腺癌異種移植模型的生物學特性。
　　 結果：建立ER陽性的人乳腺癌異種移植NOD/SCID鼠模型必須有雌激素輔助。在雌激素輔助下移植成功率可以達到29.6％，沒有雌激素輔助的腫瘤不能成活(P<0.01)。免疫組化和DCC測定提示移植瘤模型的ER均為陽性。HE、TUNEL等提示模型保持了原移植物的生物學特性。
　　 結論：NOD/SCID鼠乳腺癌模型傳代穩(wěn)定，符合建立模型的篩選標準，同時保持了原發(fā)癌的生物學

4、特性，表明模型鼠成功建立。
　　 二、乳腺癌干細胞的富集和微球體形成的影響因素
　　 目的：探討MCF-7細胞、BT474細胞和MDA-MB-231細胞微球體形成的影響因素，并檢測其CD44+CD24-/low的表達比例，明確富集干細胞的方法，以獲得穩(wěn)定數(shù)量的干細胞。
　　 方法：將MCF-7、BT474和MDA-MB-231乳腺癌細胞進行微球體培養(yǎng)，取培養(yǎng)第7天的微球體細胞分別進行干細胞表型的FCM檢測分析，判

5、斷干細胞富集的程度。
　　 結果：MCF-7、BT474和MDA-MB-231細胞形成微球體的效率分別為2.4％±0.2％、1.6％±0.1％和0.6％±0.05％。在通常的干細胞培養(yǎng)液中MDA-MB-231細胞很難聚團生長。但是如果去除胰島素，MDA-MB-231細胞則聚團生長。單層培養(yǎng)細胞中MCF-7、BT474和MDA-MB-231的CD44+CD24-/low的比例為10％±0.2％、0.3％±0.05％和37％±1.8

6、％，微球體細胞中CD44+CD24-/low的比例分別為8.1％±0.4％、0.6％±0.2％和93.8％±2.1％，乳腺癌細胞中表達CD44+CD24-/low細胞表型的比例明顯低于同種細胞培養(yǎng)的微球體(p<0.01)。
　　 結論：通過微球體培養(yǎng)，富集了腫瘤干細胞，但是不同乳腺癌細胞來源的微球體中干細胞所占的比例差異很大，MDA-MB-231細胞最高。
　　 三、溶瘤病毒呼腸孤病毒3型的擴增鑒定
　　 目的：

7、擴增呼腸孤病毒并且進行特異性鑒定和活力測定。
　　 方法：在LLC-MK2細胞中培養(yǎng)擴增病毒，首先通過特征性致細胞病變如細胞聚團和脫落鑒定病毒，通過Real-Time PCR(RT-PCR)鑒定病毒的純度。用TCID50進行病毒活力測定。
　　 結果：從特征性致細胞病變看LLC-MK2細胞對呼腸孤病毒非常敏感。從上清獲得的病毒的特異性得到RT-PCR確認，活力測定顯示上清中呼腸孤病毒的溶度為107.33 TCID50/m

8、l，活性很高。
　　 結論：呼腸孤病毒能夠通過LLC-MK2細胞培養(yǎng)進行擴增并純化，而且這種方法有利于保存病毒并且有利于對其結構和特性進行持續(xù)研究。
　　 四、呼腸孤病毒對乳腺癌干細胞的治療作用
　　 目的：探討呼腸孤病毒在體外對乳腺癌細胞、乳腺癌干細胞的治療作用，在體內對乳腺癌實體瘤的治療作用和對其他重要臟器的影響。
　　 方法：比較呼腸孤病毒和表阿霉素作用下MCF-7、BT474細胞及其微球體中干細胞

9、表型CD44+CD24-/low的表達變化(FCM法)以及細胞凋亡的變化(TUNEL法)，研究呼腸孤病毒對乳腺癌干細胞的治療作用。呼腸孤病毒感染人乳腺癌原位移植NOD/SCID鼠模型，通過TUNEL和HE研究該病毒在體內對腫瘤和其他重要臟器的影響。
　　 結果：在表阿霉素作用下MCF-7和BT474微球體細胞中表達CD44+CD24-/low比例明顯升高，為18％±4.5％和0.9％±0.13％(P<0.01)。病毒感染后MCF

10、-7和BT474微球體細胞中表達CD44+CD24-/low比例明顯下降，分別為0.8％±0.2％和0.2%±0.1％(P<0.05)。BT474和MCF-7微球體在應用病毒以后凋亡率上升明顯，MCF-7的凋亡率從1.9％±0.21％上升至5％±1.4％，BT474的凋亡率從0.2％±0.1％上升至1％±0.16％(P<0.05)。此外，病毒作用于NOD/SCID鼠乳腺癌動物模型，可致腫瘤細胞大量裂解消失，凋亡增加，同時對肺有損傷。