IRG1促進膠質瘤增殖的作用機制及臨床意義.pdf

1、膠質瘤(glioma)是發(fā)生于神經外胚層的腫瘤，故亦稱神經外胚層腫瘤或神經上皮腫瘤，其發(fā)病率占顱腦腫瘤的40-50％。大多數膠質瘤起源于不同類型的神經膠質細胞，但由于組織發(fā)生來源及生物學特征類似，一般都稱為神經膠質瘤。膠質瘤的分類方法很多，各型膠質瘤中，以星形細胞瘤最多，膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤次之[1]。各型膠質瘤的好發(fā)部位不同，如膠質母細胞瘤幾乎均發(fā)生于大腦半球，髓母細胞瘤發(fā)生于小腦蚓部，室管膜瘤多見于第4腦室，少突膠質瘤

2、大多發(fā)生于大腦半球，星形細胞瘤在成人中多見于大腦半球，而兒童中則多發(fā)生于小腦。膠質瘤以男性較多見，特別在多形性膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤，男性明顯多于女性。各型膠質母細胞瘤多見于中年人，室管膜瘤多見于兒童及青年，髓母細胞瘤幾乎都發(fā)生在兒童。膠質瘤的部位與年齡也有一定關系，如大腦星形細胞瘤和膠質母細胞瘤多見于成人，小腦膠質瘤（星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤）多見于兒童[2]。
　　膠質瘤大多緩慢發(fā)病，自出現癥狀至就診時間一般為數周至

3、數月，少數可達數年。惡性程度高腫瘤患者病史較短，良性腫瘤患者病史較長。腫瘤若有出血或囊變，癥狀會突然加重，甚至有類似腦血管病的發(fā)病過程。膠質瘤的臨床癥狀可分兩方面，一方面是顱內壓增高癥狀，如:頭痛、嘔吐、視力減退、復視、精神癥狀等;另一方面是腫瘤壓迫、浸潤、破壞腦組織所產生的局灶癥狀，早期可表現為刺激癥狀，如局限性癲癇，后期表現為神經功能缺失癥狀，如癱瘓。
　　炎癥反應（inflammatory reaction）指生物組織受到外

4、傷、出血或病原感染等刺激，激發(fā)的生理反應。其中，包括紅腫、發(fā)熱、疼痛等癥狀。炎性反應是先天免疫系統(tǒng)為移除有害刺激或病源體及促進修復的保護措施，并非如后天免疫系統(tǒng)般針對特定病源體[3]。炎癥反應并非等同于感染，即使很多時候炎癥的發(fā)生是因感染而引起，但通常情況下，炎癥是生物體對病源體之反應之一，是有益的，是人體的自主防御反應;然而，有時候炎癥可以引起人體自身免疫系統(tǒng)的過敏，進而攻擊自身的組織及細胞。炎癥反應是機體用于對抗感染、組織損傷等有害

5、刺激的一種重要防御機制，但是在很多情況下過度的炎癥本身就會對機體造成損害。炎癥反應的發(fā)生刺激中性粒細胞和巨噬細胞吞噬病原菌以及壞死崩解的細胞碎屑，同時巨噬細胞(macrophage)在機體的非特異免疫功能中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明在腫瘤發(fā)生初期，來自健康組織的巨噬細胞活化后可以抑制腫瘤細胞的生長，但是在腫瘤惡化階段，來自瘤體內部的巨噬細胞卻促進腫瘤細胞的生長。巨噬細胞在腫瘤發(fā)生的不同階段扮演著不同的角色。
　　目的：
　

6、　腫瘤組織中巨噬細胞的高度浸潤與腫瘤患者的預后相關?；熁蛘叻暖煶晒σ种屏鲶w生長3個月后，患者的瘤體局部有活動性炎癥出現，浸潤細胞有活化的巨噬細胞和星形膠質細胞、CD3+和CD8+的淋巴細胞，并繼發(fā)脫髓鞘的改變[4]，研究巨噬細胞介導的炎癥反應在膠質瘤的治療作用。
　　方法:
　　第一章
　　第一節(jié)：對不同種類的膠質瘤細胞進行體外培養(yǎng)，QPCR以及Westernblot驗證IRG1在膠質瘤細胞及正常細胞中的表達差異。干

7、擾IRG1觀察其對膠質瘤細胞增殖及遷移的影響。體外細胞實驗，通過Western blot檢測細胞周期蛋白、EMT相關蛋白及NF-κ B相關通路的蛋白表達水平，篩查IRG1通過何種機制促進膠質瘤細胞的增殖。
　　第二節(jié)：體內實驗，通過對裸鼠皮下注射sh-IRG1以及慢病毒攜帶IRG1的膠質瘤細胞U251及SHG-44，以注射空白載體作為對照，觀察注射膠質瘤細胞40天后腫瘤的生長情況。在體觀察IRG1表達受抑制后對膠質瘤細胞增殖能力的

8、影響。
　　第二章
　　臨床資料統(tǒng)計分析IRG1表達與膠質瘤患者病程進展及預后的關系。取人腦膠質瘤組織與正常腦組織做對比，通過Western blot比較IRG1的表達水平，觀察IRG1表達水平的高低與患者預后的關系。
　　結果:
　　第一章
　　第一節(jié)：圖1顯示IRG1在神經膠質瘤中起著重要的作用。在多株神經膠質瘤細胞株A172、U87、SHG-44、TJ-105、H4、U118MG和u-373MG中，我

9、們通過RT-PCR和免疫印跡檢測IRG1的mRNA水平和蛋白水平。圖1所見在U251、SHG-44、TJ-105和H4神經膠質瘤細胞系中IRGl mRNA及蛋白質水平明顯高于A251、U118MG和u-373細胞株。更重要的是通過和瘤旁組織組織對比，發(fā)現IRG1的蛋白高表達于膠質瘤組織(圖1D)。選用siRNA技術，特異性敲低IRG1在膠質瘤細胞中的表達，同時采用si-IRG1-1及si-IRG1-2對IRG1的表達進行敲低，結果顯示s

10、i-IRG1-2敲低效果比si-IRG1-1更佳（圖3a-b及圖4），因此，選用si-IRG1-2作為IRG1敲低的工具進行后續(xù)實驗。通過si-IRG1-1以及si-IRG1-2對U251以及SHG-44細胞進行瞬時轉染，后續(xù)MTT結果提示（圖5）敲低IRG1表達可以抑制43％的SHG-44細胞的增殖(P＜0.01)，然而過表達IRG1可以促進54％的SHG-44細胞的增殖(P＜0.01)。EUD實驗結果（圖6）顯示過表達IRG1可以使

11、得U251以及SHG-44細胞的增殖百分比從23％及25％增加至64％及62％，而通過si-IRG1-2敲低IRG1可以使U251和SHG-44細胞的增殖百分率由23％及25％下降至6％及9％。隨后，我們檢測了轉染si-IRG1-2膠質瘤細胞的細胞周期分布。實驗結果提示轉染了si-IRG1-2的U251和SHG-44細胞與轉染si-NC的對照組細胞相比，膠質瘤細胞周期分布變化為以G1期為主，少部分分布在S期，P＜0.01（圖7）。這些實

12、驗結果提示si-IRG1對膠質瘤細胞的增殖抑制部分是因為G1期阻滯?？寺⌒纬蓪嶒烇@示轉染了si-IRG1的U251及SHG-44細胞與轉染si-NC的對照組細胞相比，克隆面積更小，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖8）。劃痕實驗結果提示IRG1敲低可以減少神經膠質瘤細胞的遷移（圖9）。在EDU實驗中，我們發(fā)現敲低內源性IRG1表達組與si-NC對照組相比，IRG1敲低可明顯減少U251及SHG-44細胞的遷移及侵襲，(P＜0.0

13、5，圖10及圖11)。對穩(wěn)轉IRG1基因的U251及SHG-44膠質瘤細胞的細胞周期蛋白以及上皮間轉化的相關蛋白的表達進行檢測，發(fā)現敲低內源性IRG1表達可激活腫瘤抑制因子pRB以及致癌性細胞周期轉錄調節(jié)因子E2F1的表達，同時下調腫瘤抑制周期依賴激酶阻斷劑p21的表達，抑制周期依賴因子CDK4以及CDK6的酶活性(圖12)。再次，我們的結果提示抑制IRG1可降低EMT標記基因snail、n-鈣黏素、波形蛋白的表達，增加上皮細胞標記物E

14、-鈣粘素的表達水平(圖13)。眾多實驗結果表明NF-κ B靶基因編碼的細胞因子以及生長因子的分泌對NF-κB激活有重要的作用。NF-κ B信號通路包括了NF-κ B抑制蛋白Iκ Bs，它是通過IKK途徑磷酸化而降解。實驗結果提示敲低IRG1的表達可降低NF-κ B、IkBα以及維持腫瘤中NF-κ B活性的STAT3水平(圖14)。這些結果表明下調IRG1在膠質瘤細胞中的表達可以抑制NF-κ B介導的信號通路。
　　第二節(jié)：通過小鼠

15、體內成瘤實驗檢測IRG1在體內實驗的生物學效應。圖6A-B顯示注射敲低IRG1的U251細胞的裸鼠中腫瘤平均體積與對照組相比明顯減少（＞60％，P＜0.05，圖15a-b）。對腫瘤重量的分析顯示，接種轉染了sh-IRG1的腫瘤細胞的瘤體比轉染sh-vector組瘤體的重量更輕（P＜0.05，圖16）。這些結果再次驗證了前述的細胞實驗，說明IRG1高表達能促進膠質瘤細胞的增殖。
　　第二章
　　膠質瘤細胞胞漿中IRG1的表達水

16、平與膠質瘤患者的預后情況密切相關。IRG1免疫組化切片來源于78個膠質瘤組織塊以及16個正常腦組織塊，免疫組化染色顯示IRG2在膠質瘤細胞中有不同程度的表達（圖17C-F），但在瘤旁組織中表達很弱或者不表達（圖17A-B）。IRG1在膠質瘤細胞中的亞定位大部分在胞漿中，少部分在細胞核中。圖表七顯示IRG1高表與膠質瘤患者的病理改變密切相關，Ⅲ-Ⅳ級與Ⅰ-Ⅱ級膠質瘤患者相比，IGR1的表達增高更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)

17、。Kaplan-Meier生存分析顯示，與IRG1高表達患者相比，IRG1低表達患者具有更長的無進展生存時間(P＜0.05)。表八顯示IRG1在膠質瘤及正常腦組織中的高表達率分別為75.6％、37.5％，二者差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。
　　結論:
　　1.IRG1在膠質瘤組織中的表達高于正常腦組織。
　　2.IRG1表達與膠質瘤的臨床分級相關，可作為膠質瘤患者預后評估的獨立因素。
　　3.IRG