TGF-β1、CTGF結(jié)合雙向支架誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：關(guān)節(jié)與骨骼及肌肉一起構(gòu)成了人體活動(dòng)的最基本的運(yùn)動(dòng)單元，這三者中最為脆弱的就是關(guān)節(jié)，尤其是關(guān)節(jié)軟骨。關(guān)節(jié)軟骨由于沒有固定血管直接提供營(yíng)養(yǎng)支持，所以一旦出現(xiàn)損傷，僅依靠自身能力修復(fù)是非常困難的。如果對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨表面的損傷沒有進(jìn)行有效地干預(yù)就會(huì)出現(xiàn)疼痛，關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙及炎性滲出，在某些患者中有可能會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)退變和骨性關(guān)節(jié)炎。以往出現(xiàn)的包括微骨折技術(shù)、自體軟骨移植技術(shù)及同種異體軟骨移植技術(shù)等在內(nèi)的外科治療未能達(dá)到預(yù)期的臨床效果，近年來出現(xiàn)的

2、組織工程技術(shù)開辟了關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)新領(lǐng)域。但該項(xiàng)技術(shù)處于實(shí)驗(yàn)階段，我們需要篩選合適的種子細(xì)胞，制作優(yōu)良的支架，尋找更加合理的生長(zhǎng)因子。而細(xì)胞因子的選擇是其中的關(guān)鍵部分。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得形成軟骨的表型并促進(jìn)其增殖合成特殊的細(xì)胞外蛋白基質(zhì),比如Ⅱ型膠原及糖氨聚糖。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor,C

3、TGF）在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖及軟骨分化方面起到了關(guān)鍵作用。有實(shí)驗(yàn)表明損傷的關(guān)節(jié)軟骨在修復(fù)過程中TGF-β1、CTGF呈高表達(dá)，但是外源性聯(lián)合TGF-β1、CTGF修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究方面缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究首先建立成年新西蘭大耳白兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的動(dòng)物模型，選用BMSCs作為種子細(xì)胞，Ⅱ型膠原修飾的PLGA-HA雙向支架作為載體支架，以TGF-

4、β1及CTGF作為誘導(dǎo)種子細(xì)胞增殖及分化的生長(zhǎng)因子，在缺損形成后將種子細(xì)胞-支架-生長(zhǎng)因子的復(fù)合體植入缺損，通過觀察新生軟骨組織的大體學(xué)觀察、組織學(xué)觀察、Ⅱ型膠原基因的表達(dá)及Ⅱ型膠原含量的測(cè)定綜合評(píng)估以此方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果，進(jìn)一步與為組織工程技術(shù)將來應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)，豐富生長(zhǎng)因子的配伍組合。
　　方法：選取72只成年新西蘭大耳白兔，采用單純隨機(jī)抽樣法隨機(jī)分為四組。分組如下：A組：BMSCs+雙向支架對(duì)照組18只，編號(hào)

5、A1-A18；B組：BMSCs+雙向支架+TGF-β1組18只，編號(hào)B1-B18；C組：BMSCs+雙向支架+CTGF組18只,編號(hào)C1-C18；D組：BMSCs+雙向支架+TGF-β1+CTGF組,編號(hào)D1-D18。術(shù)后4、8、12周隨機(jī)抽取6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，留取標(biāo)本。利用1.大體觀察并評(píng)分；2.組織學(xué)觀察并評(píng)分：HE染色；3.RT-PCR法測(cè)定Ⅱ型膠原基因的表達(dá)差別；4.ELISA法確定Ⅱ型膠原的存在情況，綜合評(píng)估軟骨缺損修復(fù)情況。運(yùn)用

6、統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：（1）.肉眼觀察各組標(biāo)本軟骨缺損修復(fù)情況并評(píng)分，4周、8周和12周各組標(biāo)本缺損修復(fù)評(píng)分差異有顯著性(P<0.05)，D組最高，A組最低；各組內(nèi)互相比較得出：A組，4周、8周和12周標(biāo)本修復(fù)效果評(píng)分差異無顯著性(P>0.05)；B、C、D三組，12周缺損修復(fù)效果優(yōu)于8周及4周(P<0.05)。（2）.對(duì)四組關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的標(biāo)本切片進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯

7、示D組最高，A組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；12周評(píng)分高于4周和8周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）.RT-PCR結(jié)果顯示，四組中Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)量D組最高，A組最低，隨時(shí)間推移逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；B組與C組Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)量比較差異無明顯（P>0.05）。（4）.ELISA分析Ⅱ型膠原含量結(jié)果，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，A、B、C、D各組標(biāo)本中Ⅱ型膠原含量隨時(shí)間推移而增加，D組最高，比B組及C組高，A組最低，可認(rèn)為外源