高糖、AGEs對單核細胞磷酸戊糖途徑影響的初步研究.pdf

1、背景： 近年來，隨著生活水平的提高、生活節(jié)奏的加快和人口老齡化，糖尿病的患病率在全世界范圍內大幅度提高，成為繼心腦血管疾病、癌癥之后的人類“第三大殺手”。據(jù)統(tǒng)計，目前全球已診斷的糖尿病患者超過1.5億人，預測到2025年將增至3億人[1，2]。 糖尿病大血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的最主要原因之一，尤其是并發(fā)各種形式的心血管疾病時，其死亡率是非糖尿病人群的2～8倍，約75％～80％的糖尿病患者死于大血管病變[3-5]

2、。2001年美國膽固醇教育計劃(NationalCholesterolEducationProgram，NCEP)專家組關于成人高膽固醇血癥第三次報告(AdultTreatmentPanelⅢ，ATPⅢ)指出，2型糖尿病是心血管疾病或冠心病的等危癥[6]。因此，早期、有效地針對糖尿病大血管病變進行預防以及治療，對改善糖尿病患者預后、提高生活質量、降低死亡率均有著重要意義。 糖尿病大血管并發(fā)癥的病理基礎是動脈粥樣硬化(AS)形成。

3、而單核細胞的預激活是動脈粥樣硬化形成的早期事件，并貫穿其全過程。激活的因素包括高濃度葡萄糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advancedoxidationproteinproducts，AOPP)等[7-9]。高濃度葡萄糖、AGEs、AOPP等可促使單核細胞活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)的含量上升。ROS可能通過參與信號轉導通路

4、活化NF-KB，將信號傳遞至細胞核內，誘導炎癥相關基因的表達，從而上調機體炎癥反應，并引發(fā)單核細胞向血管內皮的黏附、趨化[10,11]。 ROS的大量增多是氧化應激的重要指標之一。氧化應激的出現(xiàn)源于細胞內氧化/抗氧化水平的失調。細胞內抗氧化物質的還原當量主要是還原型輔酶Ⅱ(NADPH)。它主要來自于糖代謝中的磷酸戊糖途徑，這一途徑的主要限速酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)。早期對磷酸戊糖途徑在細胞抗氧化中作用的認識開始于對

5、“蠶豆病”的研究。這是一種由于G6PD基因突變導致患者體內G6PD缺乏的病癥?；颊弑硇团c正常人無異，但進食蠶豆或某些藥物后容易發(fā)生溶血現(xiàn)象。一系列的研究證實：由于G6PD的主要功能就是在磷酸戊糖途徑中生產(chǎn)足夠的NADPH以對抗體內外的氧化刺激，該酶的缺乏必然導致抗氧化能力的削弱。細胞膜由膜脂和膜蛋白構成，更易遭受氧化損傷并由此引起一系列功能和結構變化，在紅細胞就表現(xiàn)為不同誘因導致的程度不等的溶血。 目前JainM[12]等人認為

6、G6PD是細胞內關鍵的抗氧化酶，它通過調節(jié)NADPH產(chǎn)量維持細胞內抗氧化物質水平，從而協(xié)調細胞內氧化還原的平衡。多項研究支持這一觀點[12-15]。近年來，美國哈佛大學醫(yī)學院Joslin糖尿病研究中心發(fā)現(xiàn)G6PD與糖尿病腎病發(fā)生機制[16]、血管內皮細胞功能紊亂[17-18]等存在密切聯(lián)系。在高糖作用下內皮細胞磷酸戊糖途徑被抑制，G6PD活性下降、NADPH含量降低同時ROS水平上升[14,16]。而利用轉染技術使牛主動脈內皮細胞過表達

7、G6PD則可以降低內源性或是外源性刺激造成的ROS積累，并提高NO水平[13]。因此磷酸戊糖途徑很可能成為新的糖尿病治療靶點。作為糖尿病大血管病變啟動因素之一的單核細胞在內環(huán)境改變時同樣存在氧化應激的狀況，這一變化是否與G6PD活性改變以致影響磷酸戊糖途徑相關，國內尚無類似研究。 本實驗將采用高濃度的葡萄糖和/或高濃度AGEs培養(yǎng)人單核細胞系U937細胞，探討磷酸戊糖途徑與單核細胞氧化應激的關系以及觀察高濃度葡萄糖、高濃度AGE

8、s這兩種物質單獨及聯(lián)合應用對單核細胞磷酸戊糖途徑的影響。 目的： 采用高濃度的葡萄糖溶液、AGEs單獨以及兩者聯(lián)合應用，觀察不同時間點U937單核細胞內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性、NADPH含量改變以及單核細胞氧化應激水平的改變，探討高濃度葡萄糖、AGEs這兩種物質及其聯(lián)合作用對單核細胞磷酸戊糖途徑的影響。 方法： 1、以U937單核細胞為實驗對象，分為4組，分別用RPMI1640完全培養(yǎng)基(

9、對照組)、含15mM葡萄糖的RPMI1640完全培養(yǎng)基(高糖組)、含100μg/mlAGEs的RPMI1640完全培養(yǎng)基(高AGEs組)、含15mM葡萄糖+100100μg/mlAGEs的RPMI1640完全培養(yǎng)基(聯(lián)合組)處理. 2、分別在30min、1h、3h、6h、12h、24h共6個時間點，采用分光光度計檢測單核細胞內G6PD活性以及NADPH含量，用熒光探針法檢測細胞內ROS產(chǎn)量3、實驗數(shù)據(jù)根據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差(

10、x±s)表示，使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析方法為連續(xù)性重復測量的方差分析。同時考慮2個分組因素和1個重復測量的時間點因素，固定其中一種因素，對其他兩種因素進行拆分，使用t檢驗兩兩比較。設檢驗標準α為0.05。 結果： 1、與對照組相比較，15mmol/L葡萄糖刺激30min至1h，U937細胞內ROS產(chǎn)生量即有顯著提高(P≤0.001，P≤0.001)，隨后出現(xiàn)產(chǎn)量一過性降低，但無統(tǒng)計學意義。刺激24h

11、后U937細胞內ROS產(chǎn)量顯著提高(P<0.01)；15mmol/L葡萄糖刺激U937細胞3h、6h時細胞內G6PD活性顯著上升(P<0.01，P<0.01)，24h后有所降低但無統(tǒng)計學意義；15mmol/L葡萄糖刺激3h后U937細胞內NADPH含量有顯著上升(P<0.05)，24h后NADPH含量有下降但無統(tǒng)計學差異。 2、與對照組相比較，100100μg/mlAGEs刺激30min、1h時細胞內ROS產(chǎn)生量顯著上升(P<0

12、.05，P<0.05)，3h時出現(xiàn)產(chǎn)量一過性降低(P<0.05)，24h后U937細胞內ROS產(chǎn)量有顯著提高(P<0.05)；100100μg/mlAGEs刺激1h、3h時細胞內G6PD活性有顯著上升(P<0.05，P<0.05)，隨后G6PD活性逐漸降低，24h后低于對照組，但無統(tǒng)計學意義；U937細胞NADPH產(chǎn)量在刺激初期30min時顯著低于對照組(P≤0.001)，隨后逐漸上升，3h時顯著高于對照組(P<0.01)，隨后逐漸降低

13、，24h時顯著低于對照組(P<0.05)。 3、與高AGEs組相比較，聯(lián)合組對細胞ROS產(chǎn)量的影響并不顯著，而與高糖組相比較，聯(lián)合作用使細胞內ROS產(chǎn)量早期(3h)出現(xiàn)一過性降低(P<0.05)，隨后逐漸上升高于對照組但仍低于高糖組(P<0.05)；細胞G6PD活性在聯(lián)合刺激早期30min、1h即比高AGEs組有顯著上升(P<0.05，P<0.05)，6h后逐漸下降，24h時顯著低于高AGEs組(P<0.01)，而較之高糖組24

14、h時聯(lián)合組G6PD活性出現(xiàn)更為顯著的下降(P<0.001)；聯(lián)合組細胞NADPH產(chǎn)量早期顯著高于高AGEs組(P<0.05)，24h后顯著低于高AGEs組(P<0.05)，而聯(lián)合組NADPH產(chǎn)量早期亦高于高糖組，但無統(tǒng)計學意義，24h時顯著低于高糖組(P<0.001)。 4、對各組G6PD活性、NADPH產(chǎn)量及ROS產(chǎn)量，葡萄糖及AGEs的影響存在交互作用。 5、高糖組、高AGEs組及聯(lián)合組各組G6PD活性與ROS產(chǎn)量呈

15、負相關(相關系數(shù)分別為r=-0.732，P≤0.001；r=-0.808，P<0.001；r=-0.735，P≤0.001)。NADPH含量與ROS產(chǎn)量呈負相關(r=-0.793，P<0.001；r=-0.679，P<0.01；r=-0.843，P<0.001)，G6PD活性與NADPH產(chǎn)量呈正相關(r=0.624，P<0.01；r=0.755，P<0.001；r=0.907，P<0.001)。對照組G6PD、NADPH、ROS三者無明