高糖、AGEs對(duì)單核細(xì)胞磷酸戊糖途徑影響的初步研究.pdf

1、背景： 近年來(lái)，隨著生活水平的提高、生活節(jié)奏的加快和人口老齡化，糖尿病的患病率在全世界范圍內(nèi)大幅度提高，成為繼心腦血管疾病、癌癥之后的人類(lèi)“第三大殺手”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球已診斷的糖尿病患者超過(guò)1.5億人，預(yù)測(cè)到2025年將增至3億人[1，2]。 糖尿病大血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的最主要原因之一，尤其是并發(fā)各種形式的心血管疾病時(shí)，其死亡率是非糖尿病人群的2～8倍，約75％～80％的糖尿病患者死于大血管病變[3-5]

2、。2001年美國(guó)膽固醇教育計(jì)劃(NationalCholesterolEducationProgram，NCEP)專家組關(guān)于成人高膽固醇血癥第三次報(bào)告(AdultTreatmentPanelⅢ，ATPⅢ)指出，2型糖尿病是心血管疾病或冠心病的等危癥[6]。因此，早期、有效地針對(duì)糖尿病大血管病變進(jìn)行預(yù)防以及治療，對(duì)改善糖尿病患者預(yù)后、提高生活質(zhì)量、降低死亡率均有著重要意義。 糖尿病大血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成。

3、而單核細(xì)胞的預(yù)激活是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期事件，并貫穿其全過(guò)程。激活的因素包括高濃度葡萄糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advancedoxidationproteinproducts，AOPP)等[7-9]。高濃度葡萄糖、AGEs、AOPP等可促使單核細(xì)胞活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)的含量上升。ROS可能通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

4、活化NF-KB，將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而上調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng)，并引發(fā)單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮的黏附、趨化[10,11]。 ROS的大量增多是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一。氧化應(yīng)激的出現(xiàn)源于細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化水平的失調(diào)。細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的還原當(dāng)量主要是還原型輔酶Ⅱ(NADPH)。它主要來(lái)自于糖代謝中的磷酸戊糖途徑，這一途徑的主要限速酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)。早期對(duì)磷酸戊糖途徑在細(xì)胞抗氧化中作用的認(rèn)識(shí)開(kāi)始于對(duì)

5、“蠶豆病”的研究。這是一種由于G6PD基因突變導(dǎo)致患者體內(nèi)G6PD缺乏的病癥?；颊弑硇团c正常人無(wú)異，但進(jìn)食蠶豆或某些藥物后容易發(fā)生溶血現(xiàn)象。一系列的研究證實(shí)：由于G6PD的主要功能就是在磷酸戊糖途徑中生產(chǎn)足夠的NADPH以對(duì)抗體內(nèi)外的氧化刺激，該酶的缺乏必然導(dǎo)致抗氧化能力的削弱。細(xì)胞膜由膜脂和膜蛋白構(gòu)成，更易遭受氧化損傷并由此引起一系列功能和結(jié)構(gòu)變化，在紅細(xì)胞就表現(xiàn)為不同誘因?qū)е碌某潭炔坏鹊娜苎?目前JainM[12]等人認(rèn)為

6、G6PD是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，它通過(guò)調(diào)節(jié)NADPH產(chǎn)量維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平，從而協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡。多項(xiàng)研究支持這一觀點(diǎn)[12-15]。近年來(lái)，美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Joslin糖尿病研究中心發(fā)現(xiàn)G6PD與糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制[16]、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[17-18]等存在密切聯(lián)系。在高糖作用下內(nèi)皮細(xì)胞磷酸戊糖途徑被抑制，G6PD活性下降、NADPH含量降低同時(shí)ROS水平上升[14,16]。而利用轉(zhuǎn)染技術(shù)使牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)

7、G6PD則可以降低內(nèi)源性或是外源性刺激造成的ROS積累，并提高NO水平[13]。因此磷酸戊糖途徑很可能成為新的糖尿病治療靶點(diǎn)。作為糖尿病大血管病變啟動(dòng)因素之一的單核細(xì)胞在內(nèi)環(huán)境改變時(shí)同樣存在氧化應(yīng)激的狀況，這一變化是否與G6PD活性改變以致影響磷酸戊糖途徑相關(guān)，國(guó)內(nèi)尚無(wú)類(lèi)似研究。 本實(shí)驗(yàn)將采用高濃度的葡萄糖和/或高濃度AGEs培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞，探討磷酸戊糖途徑與單核細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)系以及觀察高濃度葡萄糖、高濃度AGE

8、s這兩種物質(zhì)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)單核細(xì)胞磷酸戊糖途徑的影響。 目的： 采用高濃度的葡萄糖溶液、AGEs單獨(dú)以及兩者聯(lián)合應(yīng)用，觀察不同時(shí)間點(diǎn)U937單核細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性、NADPH含量改變以及單核細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的改變，探討高濃度葡萄糖、AGEs這兩種物質(zhì)及其聯(lián)合作用對(duì)單核細(xì)胞磷酸戊糖途徑的影響。 方法： 1、以U937單核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為4組，分別用RPMI1640完全培養(yǎng)基(

9、對(duì)照組)、含15mM葡萄糖的RPMI1640完全培養(yǎng)基(高糖組)、含100μg/mlAGEs的RPMI1640完全培養(yǎng)基(高AGEs組)、含15mM葡萄糖+100100μg/mlAGEs的RPMI1640完全培養(yǎng)基(聯(lián)合組)處理. 2、分別在30min、1h、3h、6h、12h、24h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用分光光度計(jì)檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)G6PD活性以及NADPH含量，用熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(

10、x±s)表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析方法為連續(xù)性重復(fù)測(cè)量的方差分析。同時(shí)考慮2個(gè)分組因素和1個(gè)重復(fù)測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)因素，固定其中一種因素，對(duì)其他兩種因素進(jìn)行拆分，使用t檢驗(yàn)兩兩比較。設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α為0.05。 結(jié)果： 1、與對(duì)照組相比較，15mmol/L葡萄糖刺激30min至1h，U937細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量即有顯著提高(P≤0.001，P≤0.001)，隨后出現(xiàn)產(chǎn)量一過(guò)性降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。刺激24h

11、后U937細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量顯著提高(P<0.01)；15mmol/L葡萄糖刺激U937細(xì)胞3h、6h時(shí)細(xì)胞內(nèi)G6PD活性顯著上升(P<0.01，P<0.01)，24h后有所降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15mmol/L葡萄糖刺激3h后U937細(xì)胞內(nèi)NADPH含量有顯著上升(P<0.05)，24h后NADPH含量有下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、與對(duì)照組相比較，100100μg/mlAGEs刺激30min、1h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量顯著上升(P<0

12、.05，P<0.05)，3h時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)量一過(guò)性降低(P<0.05)，24h后U937細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量有顯著提高(P<0.05)；100100μg/mlAGEs刺激1h、3h時(shí)細(xì)胞內(nèi)G6PD活性有顯著上升(P<0.05，P<0.05)，隨后G6PD活性逐漸降低，24h后低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；U937細(xì)胞NADPH產(chǎn)量在刺激初期30min時(shí)顯著低于對(duì)照組(P≤0.001)，隨后逐漸上升，3h時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，隨后逐漸降低

13、，24h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。 3、與高AGEs組相比較，聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞ROS產(chǎn)量的影響并不顯著，而與高糖組相比較，聯(lián)合作用使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量早期(3h)出現(xiàn)一過(guò)性降低(P<0.05)，隨后逐漸上升高于對(duì)照組但仍低于高糖組(P<0.05)；細(xì)胞G6PD活性在聯(lián)合刺激早期30min、1h即比高AGEs組有顯著上升(P<0.05，P<0.05)，6h后逐漸下降，24h時(shí)顯著低于高AGEs組(P<0.01)，而較之高糖組24

14、h時(shí)聯(lián)合組G6PD活性出現(xiàn)更為顯著的下降(P<0.001)；聯(lián)合組細(xì)胞NADPH產(chǎn)量早期顯著高于高AGEs組(P<0.05)，24h后顯著低于高AGEs組(P<0.05)，而聯(lián)合組NADPH產(chǎn)量早期亦高于高糖組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24h時(shí)顯著低于高糖組(P<0.001)。 4、對(duì)各組G6PD活性、NADPH產(chǎn)量及ROS產(chǎn)量，葡萄糖及AGEs的影響存在交互作用。 5、高糖組、高AGEs組及聯(lián)合組各組G6PD活性與ROS產(chǎn)量呈

15、負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.732，P≤0.001；r=-0.808，P<0.001；r=-0.735，P≤0.001)。NADPH含量與ROS產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.793，P<0.001；r=-0.679，P<0.01；r=-0.843，P<0.001)，G6PD活性與NADPH產(chǎn)量呈正相關(guān)(r=0.624，P<0.01；r=0.755，P<0.001；r=0.907，P<0.001)。對(duì)照組G6PD、NADPH、ROS三者無(wú)明