截短型4E-BP2以及藏紅花素對大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6的影響.pdf

1、研究背景:
　　惡性膠質(zhì)瘤高達5/10萬的患病率,使其在世界范圍內(nèi)仍是一個難題,其中美國每年新發(fā)現(xiàn)的患病人數(shù)高達14000例,我國每年可達55000左右,且近年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病率呈增長態(tài)勢。其中膠質(zhì)母細胞瘤的比例占到惡性膠質(zhì)瘤的60-70％。雖然各種先進的設備、技術(shù)的應用給腫瘤治療帶了福音,但是惡性膠質(zhì)瘤死亡率仍無下降走勢,有效降低惡性膠質(zhì)瘤的死亡率仍然是世界性的研究熱點,因次探究有效地治療措施以提高惡性膠質(zhì)瘤的臨床控制

2、率勢在必行。
　　近幾年研究顯示,真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)的過程中翻譯起始因子eIFs是起關鍵作用的一類蛋白分子,其中eIF4E作為治療惡性腫瘤的靶向目標日益受到重視。mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)是一個基本的過程,但是有合理的控制系統(tǒng),主要控制發(fā)生在起始階段。在真核細胞中,eIF4F復合物由eIF4E、eIF4A以及eIF4G共同組成,啟動具有5'帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯過程。eIF4E結(jié)合蛋白(eIF4E binding

3、 proteins,4E-BPs)控制著eIF4F復合物能否成功裝配。4E-BPs的磷酸化水平是其與eIF4E結(jié)合的關鍵,PTEN/PI3K/AKt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路在4E-BPs的磷酸化過程中起主導作用,同時需要mTOR對氨基末端RAIP基序和羧基末端TOS基序的識別。RAIP基序具有識別4E-BP2氨基末端以及羧基末端磷酸化位點的功能,而S65以、T70以及雷帕霉素的磷酸化敏感位點由TOS基序識別。綜上所述,我們考慮同時剔除RA

4、IP和TOS基序能夠抑制4E-BP2被磷酸化,進而阻止eIF4F復合物的組合,從而抑制腫瘤細胞的生長并且促進凋亡。
　　中醫(yī)藥是祖國醫(yī)學的“瑰寶”,也是腫瘤防治研究的一個重要領域。近年來研究顯示中草藥藏紅花(Crocus sativus L,Saffron)的有效成分藏紅花素(Crocin)對多種腫瘤細胞具有明顯的抗癌活性,且?guī)缀跷窗l(fā)現(xiàn)正常組織細胞生理功能受到影響,有望成為一種新型的天然抗癌藥物[56,57]。目前有關藏紅花素對膠

5、質(zhì)瘤的抗瘤作用及機制研究,國際上尚未見相關報道,國內(nèi)僅有個別報道[50]。
　　實驗目的:
　　刪除4E-BP1cDNA、4E-BP2cDNA中的RAIP和TOS基序編碼序列,構(gòu)建真核表達載體,其中4E-BP1作為備用。在此基礎上,從分子生物學水平探索截短型4E-BP2對大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6的細胞增殖、凋亡的影響以及相關蛋白的表達情況;探索藏紅花素對大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞生長及對凋亡蛋白抑制因子Livin和Survivin表達的影

6、響。
　　實驗方法及結(jié)果:
　?、庞梅崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和分子克隆技術(shù)構(gòu)建截短型4E-BP1、4E-BP2的真核表達載體,并且利用雙酶切以及測序的方法鑒定其正確性。結(jié)果顯示插入序列與設計序列一直。
　　⑵通過MTT法和碘化丙啶(PI)標記流式細胞術(shù)檢測細胞增值能力。結(jié)果表明:短型4E-BP2能夠抑制大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6的增殖。
　　⑶倒置顯微鏡和Hoehst熒光染色觀察細胞形態(tài)的變化和凋亡情況;結(jié)果表明:藏紅花素對膠