NF-κB在急性肝損傷大鼠卵原細(xì)胞增殖和分化中的作用及黃芩苷的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、卵圓細(xì)胞(haptic oval cell，HOC)是肝臟的干細(xì)胞，具有多項(xiàng)分化潛能。肝臟具有強(qiáng)大的再生修復(fù)能力，只有當(dāng)損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞增殖受到抑制時(shí)，卵圓細(xì)胞被激活參與肝臟損傷修復(fù)的過(guò)程，可增殖分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，但卵圓細(xì)胞的過(guò)度增殖又有可能引發(fā)癌變，認(rèn)識(shí)調(diào)控卵圓細(xì)胞增殖分化的機(jī)制并加以干預(yù)是臨床上治療肝損傷的基礎(chǔ)。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在肝損傷中可被多種因素激活，參與多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在卵圓細(xì)胞激活過(guò)程中起重要

2、作用，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路可能成為藥物治療肝損傷的靶點(diǎn)。
　　急性肝損傷可由多種原因造成，例如酒精中毒、病毒感染、藥物、毒物等。氧化應(yīng)激是造成肝損傷的主要機(jī)制，損傷過(guò)程中有多種因子的參與，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、內(nèi)皮素-1(ET-1)等產(chǎn)生增多，作用于NF-κB，使致炎因子的表達(dá)和釋放增加，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。黃芩苷是從傳統(tǒng)中藥黃芩中提取的有效成分，屬于黃酮類化合物，已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、

3、抑制細(xì)菌、清除氧自由基等生理作用。近年來(lái)的研究表明，黃芩苷對(duì)肝臟有保護(hù)作用。但其具體的機(jī)制尚不清楚，是否作用于NF-κB，并對(duì)卵圓細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，本文將對(duì)其進(jìn)行初步研究。
　　目的:通過(guò)建立2-AAF+2/3PH急性肝損傷模型，誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖，研究在卵圓細(xì)胞增殖分化過(guò)程中NF-κB的作用，并應(yīng)用黃芩苷進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)探討黃芩苷對(duì)肝臟保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法:將健康成年SD大鼠，雌雄不限，體重200g±20g，隨機(jī)分為四組，

4、分別為假手術(shù)組(A)、模型組(B)、黃芩苷低劑量組(C)及黃芩苷高劑量組(D)。采用2-乙酰氨基芴+2/3肝切除術(shù)(2-acetylaminofluorene+twothirds partial hepatectomy，2-AAF+2/3PH)的方法建立卵圓細(xì)胞增殖模型。模型組大鼠先每天給予15mg/kg的2-AAF灌胃4天，第5天行2/3肝切除，然后繼續(xù)以原劑量灌胃5天。假手術(shù)組大鼠正常飲食，只在第5天行腹部的切開(kāi)與縫合，不切除肝臟。

5、黃芩苷干預(yù)組大鼠在2-AAF灌胃的同時(shí)灌胃黃芩苷溶液，黃芩苷低劑量組應(yīng)用50mg/kg/d、高劑量組100mg/kg/d，余同模型組，術(shù)后繼續(xù)給予黃芩苷灌胃直至處死。各組大鼠于手術(shù)后第1、7、14、21天分別處死4只大鼠并取材。
　　組織處理后行HE染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn);電鏡下觀察辨認(rèn)卵圓細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肝組織中OV6表達(dá)以觀察HOC增殖情況并對(duì)其進(jìn)行定量分析;免疫組化檢測(cè)c-kit、AFP、CK19的表達(dá)

6、來(lái)觀察HOC的分化情況;分別應(yīng)用RT-PCR法和Western Blotting檢測(cè)NF-κB表達(dá);并檢測(cè)血清中MDA、H2O2和ET-1的變化。
　　結(jié)果:①肝組織病理形態(tài)學(xué)變化:HE染色顯示，假手術(shù)組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)卵圓細(xì)胞，模型組可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫，排列紊亂，于匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)卵圓細(xì)胞，黃芩苷處理組炎癥較模型組減輕、卵圓細(xì)胞減少，其中黃芩苷高劑量組變化更明顯。②電鏡下可見(jiàn)卵圓細(xì)胞體積較小，直徑7-10μm左右，胞漿少，細(xì)胞

7、核相對(duì)大，核質(zhì)比高，胞質(zhì)內(nèi)主要為游離核糖體及少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，張力微絲束明顯可見(jiàn)。③卵圓細(xì)胞增殖分化情況:OV6、AFP、CK19、c-kit的表達(dá)隨時(shí)間變化在假手術(shù)組無(wú)明顯變化，在模型組大鼠肝切除術(shù)后第7-14天增加明顯，第14天達(dá)到峰值，之后下降，各組間的表達(dá)有差別(P＜0.05)。較模型組，黃芩苷干預(yù)組OV6表達(dá)偏低(P＜0.05)，且高劑量組較低劑量組降低更明顯(P＜0.05)，表明黃芩苷抑制肝卵圓細(xì)胞增殖;c-kit、A

8、FP表達(dá)略偏低(P＜0.05)，CK19表達(dá)偏高(P＜0.05)，表明黃芩苷影響卵圓細(xì)胞分化。④NF-κB的檢測(cè):RT-PCR和Westem Blotting均顯示，NF-κB的表達(dá)隨時(shí)間而變化，在第14天時(shí)達(dá)高峰，之后下降，趨勢(shì)與卵圓細(xì)胞增殖一致。黃芩苷干預(yù)組NF-κB的表達(dá)降低，并且黃芩苷高劑量組降低更明顯，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤血清學(xué)指標(biāo):與對(duì)照組相比，模型組的MDA、H2O2和ET-1均升高(P＜0.05)，