不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下能否進入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)及其形態(tài)隨時間的改變.pdf

1、目的:
　　1.本實驗室保存的不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下在35天的觀察期內(nèi)能否進入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)。
　　2.觀察本實驗室保存的不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下在35天的觀察期內(nèi)其革蘭染色形態(tài)隨時間的變化。
　　方法:
　　1.空腸彎曲菌菌株的復(fù)蘇和傳代:取自神經(jīng)病學(xué)實驗室（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院）-80℃冰箱中保存的格林-巴利綜合征患者分離培養(yǎng)出的空腸彎曲菌菌株LC株，lulei株，由雞糞便中分離培養(yǎng)

2、出的chicken株和非GBS源的NCTC11168株，待凍存的菌株自然消融后，接種于哥倫比亞血平板（含7％無菌脫纖維羊血）上，放置于42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件的三氣培養(yǎng)箱中，所有菌株培養(yǎng)24小時對應(yīng)的P1代菌株回收，取P1代菌落三區(qū)劃線接種于含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板上，放置于三氣培養(yǎng)箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件下，培養(yǎng)24小時獲得各菌株相應(yīng)的P2代菌株，取P2代菌落

3、三區(qū)劃線接種法接種于含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，置于三氣培養(yǎng)箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件下，培養(yǎng)24小時得到各菌株相應(yīng)的P3代菌株。
　　2.鑒定空腸彎曲菌:革蘭染色法顯示菌株為革蘭陰性桿狀菌，馬尿酸水解試驗結(jié)果顯示為陽性。
　　3.收菌用無菌接種環(huán)分別刮取4株空腸彎曲菌少量P3代細菌于盛有3ml PBS（PH為7.2+-0.1）液的無菌西林瓶內(nèi)，振蕩器振蕩充分搖勻制成菌懸液，

4、每株菌株做4個備份菌懸液并做好記號，所有的菌懸液濃度用細菌濁度儀定量在3*108 cfu/ml。
　　4.饑餓狀態(tài):將上述盛有菌懸液的無菌西林瓶置于4℃冰箱內(nèi)，不需要振蕩。
　　5.分別在菌懸液置于冰箱內(nèi)的第0天，第5天，第10天......用CTC-DAPI雙染法計數(shù)總的細菌數(shù)，活細菌數(shù)，平板直接計數(shù)法(HPC)計數(shù)可培養(yǎng)細菌數(shù)。分別對每株空腸彎曲菌的一個備份同時計數(shù)總細菌數(shù)，活細菌數(shù)及可培養(yǎng)細菌數(shù)。
　　6.平板直

5、接計數(shù)法用無菌雙蒸水連續(xù)稀釋的菌懸液樣本(0.1ml)一式三份接種到含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上。微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)42℃條件下孵育48h，計數(shù)在適當?shù)南♂尪认碌腃FUs，并可以計數(shù)原來起初的樣本中的CFUs。當可培養(yǎng)細胞少于300/ml時，0.1ml水樣本涂布在10個含5％馬血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)皿上。
　　7.CTC-DAPI雙染法在相應(yīng)的時間點，取出來自空腸彎曲菌懸浮液中的樣本并根據(jù)

6、Cappelier et al.(1997)技術(shù)用CTC和DAPI染色細胞。為了激發(fā)細胞呼吸，0.5ml腦心浸液和100μl的0.05g/mL丙酮酸溶液加入到要進行分析的0.5ml菌懸液中。CTC用雙蒸水稀釋到最終濃度即5mmo l/L，然后混合液在微需氧42℃下孵育4h。接著細胞會經(jīng)多聚黑碳膜過濾（0.2μm/孔，直徑25mm），并用5μg/mL DAPI液覆蓋5min，目的是復(fù)染。最后，染色劑會被真空抽濾，在蓋玻片蓋上前會滴上非熒光

7、的油。405nm的激發(fā)濾光片和455nm二色鏡的Olympus BX53熒光顯微鏡來觀察，這樣可以同時看到這兩種染色。隨機計數(shù)每個濾片的20個顯微視野。每個樣本，計數(shù)4個濾片。呼吸的細胞計數(shù)RCCs顯示CTC甲臘晶體，總細胞計數(shù)TCCs是用DAPI染色的。結(jié)果可以換成相應(yīng)的原始樣本中每mL細菌數(shù)，并可以計算出RCCs和TCCs的比例。實驗一式三份進行。
　　8.根據(jù)菌株的狀態(tài)計數(shù)（細菌總數(shù)，和培養(yǎng)的菌數(shù)的活菌數(shù)）繪制隨時間變化的曲

8、線，當平板計數(shù)(HPC)計數(shù)活細胞數(shù)不為零時，細菌便進入了VBNC狀態(tài)。
　　9.相應(yīng)時間點，取平板計數(shù)法后平板上生長的單菌落，進行革蘭染色。在相應(yīng)的時間點，于干凈的載玻片上滴一小滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取單菌落于生理鹽水中涂布均勻;自然干燥室溫;在酒精燈火焰幻燈片固定3～4次，每次1～2S;將載玻片置于支架上，順次使用結(jié)晶紫1min，自來水沖刷，盧戈氏碘液1min，自來水沖洗，95％酒精脫色0.5min，自來水沖洗，稀釋復(fù)紅1mi

9、n，自來水沖洗（每次自來水充分沖洗）。于室溫自然干燥后用1000倍油鏡觀察。
　　結(jié)果:
　　1.檢測的4株空腸彎曲菌菌株在35天觀察期均進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　2.空腸彎曲菌lulei菌株的VBNC狀態(tài)在饑餓20天后進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　3.空腸彎曲菌11168，lc，chicken菌株VBNC狀態(tài)在25天后進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　4.被觀察的

10、4株空腸彎曲菌顯示出了空腸彎曲菌在4℃PBS液中出現(xiàn)不同形態(tài)改變?？漳c彎曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的觀察期其形態(tài)經(jīng)歷了桿狀與球狀相互轉(zhuǎn)化，空腸彎曲菌11168菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，到第11天可見到大部分革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第21天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌?？漳c彎曲菌Lc菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第10天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球狀，第14天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色短桿狀菌，第20天革蘭染色呈

11、現(xiàn)出紅色桿菌?？漳c彎曲菌chicken菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第15天變革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第20天桿菌?？漳c彎曲菌Lulei菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第11天革蘭染色呈現(xiàn)出紫色球菌。
　　結(jié)論:
　　1.檢測的4株空腸彎益菌菌株在35天觀察期均進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。其中空腸彎曲菌lulei菌株的VBNC狀態(tài)在饑餓20天后進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。空腸彎曲菌11168

12、，lc，chicken菌株VBNC狀態(tài)在25天后進入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　2.空腸彎曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的觀察期其形態(tài)經(jīng)歷了桿狀與球狀相互轉(zhuǎn)化，空腸彎曲菌11168菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，到第11天可見到大部分革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第21天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌。空腸彎曲菌Lc菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第10天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球狀，第14天革蘭染色呈