扇貝多肽抑制UVB誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞輻射損傷的研究.pdf

1、目的:建立紫外線B(UVB)對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的病理模型，探討在UVB輻射下，扇貝多肽(PCF)抑制UVB誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞輻射損傷的作用機(jī)制。 方法:采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以流式細(xì)胞儀PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡率，采用45 mJ/cm2的UVB輻射體外培養(yǎng)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞，確立凋亡的病理模型，實(shí)驗(yàn)分為六組：正常對(duì)照組、UVB模型組、UVB+5.69 mM PCF組，UVB+2.84 mM PCF組，UVB+1.42

2、 mM PCF組和UVB+5.69 mM VitC組。首先研究PCF對(duì)UVB輻射小鼠胸腺淋巴細(xì)胞后氧化還原狀態(tài)的影響，UVB輻射后測(cè)定細(xì)胞抗羥自由基、抗超氧陰離子的水平、黃嘌啉氧化酶(XOD)和NADPH氧化酶活力；以2，7-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)為熒光探針，檢測(cè)PCF對(duì)UVB照射后細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響。其次，研究PCF對(duì)UVB誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的線粒體通路和表面受體通路的影響，分別用Rhodamine 123和F

3、luo-3-AM熒光染色測(cè)定線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞Bcl-xl和Bid基因蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)caspase-3的活性；western-blot檢測(cè)線粒體細(xì)胞色素C(cytochromec)的釋放、FADD和caspase-8基因蛋白的表達(dá)；電鏡分析PCF和caspase-8抑制劑(z-IETD-fmk)對(duì)UVB誘導(dǎo)的胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的影響；RT-PCR檢測(cè)Fas(CD95)mRNA的表達(dá)。最后，使

4、用基因芯片技術(shù)分析PCF對(duì)UVB輻射后小鼠胸腺淋巴細(xì)胞基因譜的差異表達(dá)影響。Westem-blot檢測(cè)硫氧還蛋白(Trx)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt/PKB)的活性，預(yù)先加入或不加入PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002檢測(cè)細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Ⅰ(apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1)、JNK的活性、DNA ladder和線粒體膜電位(△ψM)；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞p53基因

5、蛋白的表達(dá)：原位雜交檢測(cè)細(xì)胞p38 mRNA、p21 mRNA的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)c-fos mRNA和c-jun mRNA的表達(dá)；結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，45 mJ/cm2的UVB輻射小鼠胸腺淋巴細(xì)胞后2h為最佳凋亡模型；在1.42mM～5.69mM濃度范圍內(nèi)，PCF能提高抗羥自由基和抗超氧陰離子的水平，降低胸腺淋巴細(xì)胞中黃嘌啉氧化酶、NADPH氧化酶的活力和ROS的含量。PCF可調(diào)節(jié)線粒體通路和表面受體通路上凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，穩(wěn)

6、定線粒體的膜電位，降低淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子，使Bcl-xl蛋白表達(dá)升高而Bid蛋白表達(dá)降低：PCF抑制線粒體cytochrome c的釋放，使caspase-3的活性降低；PCF可抑制表面受體通路上Fas mRNA、FADD和caspase-8基因蛋白的表達(dá)：當(dāng)預(yù)先給予caspase-8抑制劑和PCF能夠減輕UVB對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損害。基因芯片結(jié)果顯示，與模型組相比，PCF組有功能差異表達(dá)的基因共104個(gè)，其中上調(diào)基因56個(gè)，下調(diào)基因4

7、8個(gè)：western-blot結(jié)果提示，PCF能夠提高小鼠胸腺淋巴細(xì)胞硫氧還蛋白的表達(dá)，激活A(yù)KT的活性，抑制ASKl-JNK/p38凋亡通路的活化。預(yù)先使用P13K/Akt通路特異性抑制劑LY294002，DNA ladder片段增多，線粒體膜電位降低；此外，PCF可提高細(xì)胞周期相關(guān)基因p53蛋白的表達(dá)和p21mRNA的表達(dá)；降低轉(zhuǎn)錄因子c-fos mRNA和c-jun mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：PCF能夠改善由UVB輻射誘導(dǎo)的