光動(dòng)力療法聯(lián)合DC對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤的抑制作用及免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：光動(dòng)力學(xué)療法(Photodynamic therapy，PDT)是應(yīng)用于腫瘤和非腫瘤性疾病的一種局部治療方法。PDT可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。PDT與免疫療法(Immunotherapy，IT)的聯(lián)合，即光免疫療法(Photoimmunotherapy，PIT)不但放大、增強(qiáng)了機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)，也降低了其副作用的產(chǎn)生。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)作為一種專(zhuān)職的抗原遞呈細(xì)胞(Ant

2、igen presenting cell，APC)，對(duì)T細(xì)胞的活化具有專(zhuān)一性，可啟動(dòng)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PDT對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性研究，探討PDT聯(lián)合DC的光免疫療法對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤的抗腫瘤及免疫效應(yīng)，探索一種新的綜合療法，為腫瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠骨髓源性DC細(xì)胞，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)熒光染色

3、液標(biāo)記DC后備用。128只6～8周齡雄性健康昆明小鼠皮下接種Heps肝癌細(xì)胞，建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、單純PDT組、IT組和PIT組；每組32只。對(duì)照組小鼠瘤體內(nèi)均勻注射同等體積的生理鹽水，PDT組小鼠尾靜脈注射光敏劑多替泊芬20mg/kg體重，24小時(shí)后光照腫瘤局部，功率密度為200mW/cm2，能量密度為180J/cm2。IT組小鼠行瘤體內(nèi)均勻注射DAPI標(biāo)記的DC細(xì)胞5×105個(gè)/只。PIT組于照光后即刻行

4、瘤體內(nèi)均勻注射DAPI-DC5×105個(gè)/只。(1)觀察各組小鼠生存期；(2)測(cè)量各組小鼠的腫瘤體積大小，計(jì)算抑瘤率；(3)于治療后12、24及48h分別取IT組和PIT組小鼠腋下近腫瘤側(cè)淋巴結(jié)制備組織拓片，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞數(shù)目；(4)與治療后12和72h小鼠瘤組織取材，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin，HE)染色后光學(xué)顯微鏡觀察；(5)各組小鼠瘤組織切片，分別應(yīng)用Bcl-2抗體、Bax抗體行免

5、疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry，IHC)；(6)各組分別于治療后12h、24h、72h、7d、14d分批處死4只小鼠，摘眼球法取小鼠外周血，流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠外周血T細(xì)胞亞群變化；(7)于上述時(shí)間點(diǎn)收集各組小鼠外周血并分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子白介素(Interleukin，IL)-12水平；(8)治療后7d

6、取各組小鼠脾臟無(wú)菌制備小鼠脾細(xì)胞懸液，以小鼠Heps肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)釋放法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞毒活性。
　　結(jié)果：1.體外成功誘導(dǎo)擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源DC細(xì)胞。
　　2.成功建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型，成瘤率98％。
　　3.各組小鼠生存時(shí)間：PDT組和PIT組小鼠的生存時(shí)間與對(duì)照組及單純細(xì)胞治療組相比，明顯延長(zhǎng)(P<0.01，P<0.01)。PIT組小鼠

7、生存時(shí)間較PDT組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，IT組小鼠與對(duì)照組生存時(shí)間無(wú)明顯差異。
　　4.各組小鼠腫瘤體積及抑瘤率：PIT組、PDT組治療后2、8和16d移植瘤的體積較IT組和對(duì)照組明顯縮小(P<0.05)，治療后8和16d PIT組腫瘤體積較單純PDT組腫瘤體積明顯縮小(P<0.01)；各時(shí)間點(diǎn)IT組小鼠腫瘤體積與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PDT組和PIT組治療后16天的抑瘤率分別為：56.73％、79.88

8、％。
　　5.熒光顯微鏡下觀察小鼠近腫瘤側(cè)腋下局部引流淋巴結(jié)中熒光細(xì)胞數(shù)目：治療后12、24及48h IT組和PIT組小鼠淋巴結(jié)中均可見(jiàn)DAPI-DC，至48h達(dá)到高峰。但各時(shí)間點(diǎn)平均每視野中熒光細(xì)胞數(shù)IT組較PIT組多；治療后12、24h IT組小鼠局部引流淋巴結(jié)中熒光細(xì)胞數(shù)目明顯高于PIT組(P<0.01)；治療后48h IT組較PIT組相比P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.各組小鼠腫瘤HE染色：對(duì)照組腫瘤細(xì)胞分

9、布密集，細(xì)胞變性壞死及免疫細(xì)胞少見(jiàn)，微血管豐富。PDT后12h可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞退變明顯，呈空泡狀變性，間質(zhì)內(nèi)微血管受損，腫瘤組織周?chē)梢?jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。PDT后72h可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)消失，呈凝固性壞死，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。PIT組治療后較單純PDT組壞死面積大，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。IT組治療后與對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化。
　　7.各組小鼠腫瘤Bax-IHC染色：治療后48h，PDT組和PIT組Bax蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及單純細(xì)胞治療組(P<0.

10、01)。
　　8.各組小鼠腫瘤Bcl-2-IHC染色：治療后48h，PDT組和PIT組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組及IT組(P<0.01)。
　　9.治療后72h，PDT和PIT組小鼠外周血CD3+CD8+T細(xì)胞百分率較對(duì)照組與IT組顯著升高(P<0.05，P<0.01)，此時(shí)達(dá)到高峰。而PIT組小鼠外周血CD3+CD8+T較PDT升高明顯(P<0.01)，至治療后2w仍可維持在相對(duì)高水平。對(duì)照組與IT組小鼠外周血CD3

11、+CD8+T細(xì)胞數(shù)無(wú)增高趨勢(shì)。
　　10.各組小鼠血清中IL-12水平：PDT組和PIT組小鼠外周血清細(xì)胞因子IL-12水平較荷瘤對(duì)照組與IT組明顯升高(P<0.05，P<0.01)；至治療后72h最高，達(dá)到峰值。其中PIT組升高顯著，各設(shè)定時(shí)間點(diǎn)均明顯高于單純PDT治療組(P<0.01)。
　　11.治療后7d各組小鼠脾細(xì)胞活性：效靶比為10:1時(shí)，PDT組和PIT組的脾細(xì)胞殺傷活性高于對(duì)照組和IT組(P<0.05，P<0

12、.01)；效靶比為20:1和50:1時(shí)，PDT組和PIT組的脾細(xì)胞殺傷活性明顯高于對(duì)照組和IT組(P<0.01)。各效靶比PIT組小鼠脾細(xì)胞殺傷活性較PDT組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　結(jié)論：1.成功制備小鼠骨髓源性DC。
　　2.PDT可使小鼠Heps肝癌細(xì)胞變性壞死，并通過(guò)上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，損傷微循環(huán)，明顯延長(zhǎng)生存時(shí)間。
　　3.PDT可誘導(dǎo)CD3+CD8+T細(xì)胞活化，使外周