惡性膠質(zhì)瘤細胞遷移方向指示及趨化引導(dǎo)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，約占所有成人顱內(nèi)腫瘤的40％～50％[1]，其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）惡性程度最高，預(yù)后極差[2]。如果僅進行支持治療，膠質(zhì)母細胞瘤病人的中位生存期不足3個月，97％的病人在12個月內(nèi)死亡;采用手術(shù)切除并輔以放射治療和化學(xué)治療的方案后，病人的中位生存期仍不足12個月[3]。近十余年來，盡管隨著外科手術(shù)技術(shù)的提高以及新的放化療方案的應(yīng)用，膠質(zhì)母細胞

2、瘤患者的總體生存期有所延長，但是絕大多數(shù)患者仍然避免不了腫瘤復(fù)發(fā)和最終走向死亡的噩運。
　　 惡性膠質(zhì)瘤侵襲遷移的生物學(xué)特性嚴(yán)重制約了療效的進一步提高，同時也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的主要原因。因此，對惡性膠質(zhì)瘤侵襲遷移特點及機制的研究將對改善其臨床治療具有重要意義。然而，目前我們在研究腫瘤細胞遷移時仍缺乏能夠在組織切片中指示細胞運動方向的指標(biāo)。高爾基體(golgi)作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的加工修飾場所廣泛存在于真核細胞中。有研

3、究證明，高爾基體參與細胞微管形成中心的構(gòu)成，并且在細胞極性的建立、維持和細胞遷移運動過程中發(fā)揮重要作用[4,5]。
　　 惡性膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)侵襲遷移的途徑與大腦的解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細胞可以沿著腦白質(zhì)纖維束、血管外膜、軟膜以及室管膜浸潤播散，其中主要是沿著有髓白質(zhì)纖維[6,7]。此外，趨化因子在細胞遷移運動過程中發(fā)揮重要作用。Zagzag等[8]發(fā)現(xiàn)與細胞定向遷移相關(guān)的基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromalcell

4、-derivedfactor-1α，SDF-1α)和其特異性受體CXCR4在血管周圍以及白質(zhì)纖維束和軟膜下表達。因此，我們推測惡性膠質(zhì)瘤細胞可能是在SDF1/CXCR4軸的引導(dǎo)下，沿著血管基底膜或沿白質(zhì)纖維束以血管niche為中繼站向周圍方向浸潤性生長。
　　 本課題研究分為以下二個部分:
　　 第一部分通過免疫熒光染色的方法觀察體外劃痕實驗中C6細胞、U251細胞和SNB19細胞在運動遷移過程中高爾基體在細胞中的定位與

5、細胞運動方向的關(guān)系;鬼筆環(huán)肽細胞骨架染色，觀察高爾基體與細胞運動偽足的位置關(guān)系;免疫組化染色觀察人腦和大鼠腦膠質(zhì)瘤組織切片中細胞高爾基體在細胞中的定位與細胞運動方向的關(guān)系，進而探究高爾基體作為細胞運動方向指示的可行性及其在研究細胞遷移運動方面的生物學(xué)意義。結(jié)果顯示:體外劃痕實驗中位于劃痕兩側(cè)的絕大多數(shù)C6細胞(83％±6％)、U251細胞(80％±7％)、SNB19細胞(82％±6％)的高爾基體朝向劃痕空白側(cè);鬼筆環(huán)肽細胞骨架染色顯示U

6、251細胞和SNB19細胞中高爾基體的定位方向與細胞的偽足伸展方向一致;免疫組化染色顯示，腫瘤組織標(biāo)本中壞死區(qū)周圍腫瘤細胞的高爾基體多數(shù)（鼠腦80％±7％;人腦82％±6％）背向壞死側(cè)。
　　 第二部分通過免疫熒光染色、Westernblot檢測CXCR4和SDF-1α在C6細胞、U251細胞、U87細胞和HUVEC中的表達;免疫組化染色檢測CXCR4和SDF-1α在腫瘤標(biāo)本中的表達;利用Transwell細胞遷移實驗探究SDF

7、-1/CXCR4在腫瘤細胞遷移運動過程中的作用，根據(jù)下室所加趨化劑差異實驗分為5組，對照組:加入600μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基;SDF-1α誘導(dǎo)組:加入600μ.l含SDF-1α(100nmol/ml)的無血清DMEM培養(yǎng)基;HUVEC上清誘導(dǎo)組:加入600μl提前制備好的人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清;H+AMD3100處理組:加入600μl含AMD3100（25μg/ml）的人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清;S+AMD3100處理組:加入60

8、0μl含SDF-1α(100nmol/ml)和AMD3100（25μg/ml）的無血清DMEM培養(yǎng)基。運用立體定向注射技術(shù)建立C6細胞Wistar大鼠腦胼胝體原位移植模型，通過免疫組織化學(xué)染色、鏡像切片H&E和白質(zhì)纖維束染色研究腫瘤細胞在腦白質(zhì)中的遷移特點以及分布規(guī)律。結(jié)果顯示:C6細胞、U251細胞和U87細胞中表達CXCR4，HUVEC中表達SDF-1α;腫瘤標(biāo)本免疫組化染色顯示腫瘤細胞表達CXCR4，血管內(nèi)皮細胞表達SDF-1α;

9、transwell實驗中對照組(C6:2.9±1.8;U251:3.1±1.8;U87:2.3±1.8)和SDF-1α+AMD3100組(C6:2.8±1.5;U251:2.1±1.0;U87:1.7±1.2)中有極少量的細胞能夠穿過小室膜，并且穿過小室膜的細胞形態(tài)不佳(P＞0.05);SDF-1α(C6:107.5±15.6;U251:110.7±13.1;U87:109.5±13.5)和HUVEC上清液(C6:99.6±13.2;U

10、251:104.7±13.1;U87:106.9±12.7)都對細胞有很強的趨化作用，兩組之間對比沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);H+AMD3100處理組(C6:20.1±4.5;U251:15.6±3.8;U87:15.1±4.3)細胞的趨化運動明顯受到影響，與HUVEC上清組對比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);S+AMD3100處理組細胞的趨化運動明顯受到影響，與SDF-1α組對比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);鏡像切片

11、H&E和白質(zhì)纖維束染色顯示腫瘤細胞在腦內(nèi)沿白質(zhì)纖維束的走行方向在纖維束間遷移運動并在微血管旁聚集;免疫組化Ki-67染色顯示聚集在微血管旁的腫瘤細胞具有較高的增殖活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.腫瘤細胞高爾基體的定位方向?qū)τ谂袛囿w內(nèi)、外細胞的遷移運動方向具有參考意義。
　　 2.惡性膠質(zhì)瘤細胞能夠在腦內(nèi)沿著白質(zhì)纖維束的走行方向在纖維束間遷移運動，當(dāng)腫瘤細胞遷移路徑中出現(xiàn)微血管時，部分腫瘤細胞會趨向于微血管旁nic