自閉癥模型大鼠腦區(qū)Wnt-β-catenin通路相關(guān)基因甲基化修飾及通路活性變化的研究.pdf

1、自閉癥(autism)是一種廣泛性神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,一般于3歲前發(fā)病,主要表現(xiàn)出語言交流艱難、社會(huì)交往障礙、重復(fù)刻板行為三大核心臨床癥狀。此外,autism患者多有個(gè)顯著頭部發(fā)育特征,即2～5歲時(shí)腦過度增長(zhǎng),大于同齡健康兒童。目前,autism的發(fā)病原因尚不清楚,普遍認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,如妊娠早期丙戊酸鹽(Valproate,VPA)暴露會(huì)大大增加子代罹患autism的風(fēng)險(xiǎn)。
　　Wnts蛋白是一類參與神經(jīng)系

2、統(tǒng)發(fā)育的重要信號(hào)分子,在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中,Wnts蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白受體(Frizzled,Frz)結(jié)合而激活下游的散亂蛋白(Dishevelled,Dv1),隨后抑制GSK-3β、Axin和APC等分子復(fù)合體的形成,從而減少胞漿內(nèi)β-catenin的降解。β-catenin蓄積并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)報(bào)道,多種神經(jīng)精神性疾病,如autism、精神分裂和抑郁癥等,都

3、可能與Wnt信號(hào)通路異常有關(guān)。有資料顯示wnt2基因的突變與autism的發(fā)病有顯著的相關(guān)性:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,敲除了Wnt通路中dvl-1基因的小鼠表現(xiàn)出類似autism的社會(huì)行為障礙,也強(qiáng)烈提示W(wǎng)nt信號(hào)通路與autism的發(fā)病有關(guān)。研究表明,表觀遺傳機(jī)制參與了autism的發(fā)病。DNA甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象,是后天性的基因修飾過程,是基因?qū)ν饨绛h(huán)境因素發(fā)生應(yīng)答的重要機(jī)制,一般的規(guī)律是:甲基化可抑制基因的表達(dá),而去甲基化則可

4、表現(xiàn)出基因活躍表達(dá)。在一定的遺傳易感性基礎(chǔ)上,環(huán)境因素通過改變表觀遺傳信息如基因組甲基化模式而影響特定基因的表達(dá),進(jìn)而影響腦的發(fā)育,導(dǎo)致autism的發(fā)生。
　　那么,autism患者腦內(nèi)是否存在Wnt信號(hào)通路及表觀遺傳修飾異常?Wnt信號(hào)通路活性變化與表觀遺傳機(jī)制異常是否存在聯(lián)系?目前尚不清楚。針對(duì)這這些問題,本課題集中研究autism動(dòng)物模型及培養(yǎng)神經(jīng)元中Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因的甲基化修飾及其與該通路活性變化的

5、關(guān)系,以探討autism發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制。我們主要進(jìn)行了以下三方面的工作:
　　一、采用Wistar大鼠,在妊娠第12.5天時(shí),腹腔注射(intraperitoneal injecting,ip)VPA制作子代autism大鼠模型,并運(yùn)用熱板致痛法、傾斜板實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮及Nissl染色等方法對(duì)模型大鼠進(jìn)行行為和形態(tài)學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,autism模型組大鼠腦發(fā)育異常、睜眼時(shí)間推遲、方向趨向性機(jī)能及傷害性

6、知覺下降、游泳能力差、重復(fù)刻板動(dòng)作增加、學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力差。這些表現(xiàn)與人類autism患者的某些特征極為相似,表明用VPA注射法較成功地制作出了autism大鼠模型。
　　二、Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因甲基化修飾的研究。運(yùn)用甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)和硫轉(zhuǎn)化DNA測(cè)序技術(shù)(Bisulfite DNA sequencing,BDS)檢測(cè)VPA模型大鼠額葉皮層和

7、海馬腦區(qū)及培養(yǎng)神經(jīng)元Wnt通路信號(hào)蛋白Wnt1、Wnt2、WIF-1及DKK1等相關(guān)基因啟動(dòng)區(qū)的甲基化修飾。MSP結(jié)果顯示,在VPA模型大鼠額葉皮層和海馬腦區(qū)及VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中,Wnt通路刺激性信號(hào)蛋白Wnt1和Wnt2基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.001),Wnt通路抑制性信號(hào)蛋白WIF-1和DKK1基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化水平與對(duì)照組比較未見顯著性差異(P＞0.05)。BDS結(jié)果顯示,wnt1基因啟動(dòng)子區(qū)從-72

8、3到-328共395bp的片斷所含26CpG雙核苷酸中,VPAautism模型組大鼠額葉皮層和海馬組織的去甲基化數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P＜0.01～0.001);wnt2基因啟動(dòng)子區(qū)從-400到-150共250bp的片斷所含21CpG雙核苷酸中,VPAautism模型組大鼠額葉皮層和海馬組織的去甲基化數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),BDS與MSP的結(jié)果相一致。Western blot顯示,VPA處理對(duì)重要表觀遺傳修飾因子DNMT3b(

9、DNA methyltransferase 3b)的表達(dá)無影響。上述結(jié)果表明VPA處理具有誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的去甲基化作用。
　　三、為揭示W(wǎng)nt/β-catenin通路相關(guān)基因甲基化修飾對(duì)該通路活性的影響,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR,Western blot及免疫熒光染色技術(shù)深入研究autism模型大鼠及原代培養(yǎng)神經(jīng)元Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性變化,以及其對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的作用。實(shí)時(shí)定量PCR及We

10、stern blot結(jié)果顯示,在VPA模型大鼠額葉皮層和海馬腦區(qū)及VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中,wnt1和wnt2mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,并且與VPA劑量呈現(xiàn)正比關(guān)系,與啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(wnt1:R2=0.9621,P＜0.01;wnt2:R2=0.7805,P＜0.05)。免疫熒光組織化學(xué)、Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR顯示,Wnt/β-catenin通路效應(yīng)分子β-catenin及其靶基因在VPA自閉

11、模型組及神經(jīng)元中含量升高,表明Wnt/β-catenin通路活性上調(diào);VPA處理促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng),表現(xiàn)為突起數(shù)目和總長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組;而Wnt/β-catenin通路抑制劑能顯著抑制VPA誘導(dǎo)的神經(jīng)元生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因甲基化修飾導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路活性上調(diào),VPA促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)可能由于該通路上調(diào)所致。
　　綜上所述,我們的工作提示:環(huán)境因素(如VPA暴露)通過表觀遺傳效應(yīng)誘導(dǎo)腦