瘦素在異位骨化形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、異位骨化（heterotopic ossification，HO）是指在正常情況下沒有骨組織的軟組織內(nèi)形成的新生骨，它不同于高鈣血癥、營養(yǎng)不良等代謝性疾病所致的局部鈣化，它形成的是成熟的板層新生骨。根據(jù)形成原因，HO可以分為四種類型：創(chuàng)傷后HO、神經(jīng)源性HO、遺傳性HO及燒傷、血友病、鐮刀細(xì)胞型貧血、脊髓灰質(zhì)炎、破傷風(fēng)、多發(fā)硬化引起的HO，其中以創(chuàng)傷后HO最為常見。它常發(fā)生于肌肉骨骼創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)脫位、髖、膝、肩、肘關(guān)節(jié)置換和骨折內(nèi)固定等外

2、科手術(shù)后。HO對骨科醫(yī)生一直是個挑戰(zhàn)，特別在創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)置換領(lǐng)域，它可以導(dǎo)致疼痛、關(guān)節(jié)活動范圍減小，甚至關(guān)節(jié)強(qiáng)直需要外科手術(shù)干預(yù)。然而，對HO的發(fā)病機(jī)制至今仍然缺乏足夠的認(rèn)識，Chalmers等提出了HO形成必需的三個條件：①成骨的前體細(xì)胞；②成骨誘導(dǎo)物；③允許成骨的組織環(huán)境，并認(rèn)為HO的形成與否取決于局部和全身多種刺激成骨和抑制成骨因素相互作用的結(jié)果。諸多學(xué)者認(rèn)為HO的形成起源于軟組織內(nèi)的多潛能干細(xì)胞，在特定的成骨誘導(dǎo)因子作用下分化為成

3、骨細(xì)胞。這些因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor-β，TGF-β）、堿性成纖維生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長因長（Insulin-like growth factor，IGF）等，此外還有一些沒有確定的骨調(diào)節(jié)生物活性因子?；趯Ψ逝只虻难芯浚?994年美國Howard Hughes醫(yī)學(xué)研究所首次通過ob/o

4、b小鼠基因定位克隆發(fā)現(xiàn)了ob基因表達(dá)產(chǎn)物——瘦素（Leptin，LEP）。LEP是一個由白色脂肪組織分泌、167個氨基酸組成的多肽，分子量為16kU，作為一個骨調(diào)節(jié)因子，LEP和其受體廣泛存在機(jī)體各種組織中，暗示其可能參與了多種代謝的調(diào)節(jié)。它不僅是調(diào)節(jié)攝食和能量平衡的一個細(xì)胞因子，還具有活化巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、促進(jìn)造血和血管生成、促進(jìn)膠原合成、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、增強(qiáng)免疫功能，在創(chuàng)傷、應(yīng)激、感染及組織修復(fù)過程中發(fā)揮一定的保

5、護(hù)機(jī)制。臨床上對LEP在肥胖癥、心血管疾患、Ⅱ型糖尿病、腎臟病、乳腺癌、脂肪肝、不育癥、骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究較多，但LEP是否參與了HO的形成仍不清楚，對這方面的研究，國內(nèi)外罕見報道。近年來，隨著人工關(guān)節(jié)的廣泛應(yīng)用及骨折切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)的普及，HO的發(fā)病率顯著增高，其發(fā)病機(jī)制不明，缺乏理想的預(yù)防和治療方法，致殘率很高，因此，其病因和發(fā)病機(jī)制受到廣泛關(guān)注，對這一課題進(jìn)行廣泛深入的研究將具有深遠(yuǎn)地意義。 第一章、

6、Leptin在跟腱切斷術(shù)誘導(dǎo)異位骨化模型大鼠骨化組織中的表達(dá)。 目的： 通過跟腱切斷法建立大鼠HO模型，并初步研究其形成機(jī)制；測定模型大鼠血清LEP、骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）水平，并分析二者之間的相關(guān)性；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcrip tion poly-merase chain reaction，RT-PCR）和免疫組化法分別檢測大鼠跟腱

7、和周圍軟組織中LEPmRNA和蛋白的表達(dá)情況。 方法： 36只雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠隨機(jī)分為3組（n=12）：單純切開皮膚組（Sham）、跟腱半切組（Partial Achilles' tenotomy，PAT）、跟腱全切斷組（Achilles' tenotomy，AT），于術(shù)后5、10周分別行跟腱X線和組織學(xué)檢查，觀察異位骨形成情況；采集術(shù)前和術(shù)后（5、10 w）的血液樣品用于測定LEP和BAL

8、P；同時，采用RT-PCR和免疫組化法分別檢測大鼠跟腱和周圍軟組織中LEP mRNA（5、10w）和蛋白（10w）表達(dá)情況。 結(jié)論： 跟腱切斷術(shù)能有效誘導(dǎo)大鼠HO，該方法簡單、有效、易行，結(jié)果穩(wěn)定，這種異位骨是通過軟骨化骨形成；HO模型大鼠血清LEP增加，且和BALP呈正相關(guān)，且在HO跟腱分離組織中有較強(qiáng)的LEP和LEP mRNA的表達(dá)?；谝陨线@些證據(jù)，本文認(rèn)為LEP可能參與了HO的形成，其機(jī)制為：促進(jìn)各類細(xì)胞的增殖/

9、分化、膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)的礦化和血管化來誘導(dǎo)骨形成和成熟。 第二章、Leptin對thBMP-2誘導(dǎo)裸鼠異位成骨效能的影響。 目的： 研究LEP對基因重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Recombinant human bone morphogenetic protein-2，thBMP-2）誘導(dǎo)裸鼠異位成骨效能的影響，探討LEP和thBMP-2對異位成骨的聯(lián)合作用，并分析其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：

10、 以膠原（Collagen，COL）材料作為載體，與不同的生長因子進(jìn)行復(fù)合，根據(jù)復(fù)合生長因子的有無和不同分為A組：COL；B組：COL+LEP；C組：COL+rhBMP-2；D組：COL +rhBMP-2+LEP。在裸鼠（n=12）皮下分別植入這四種材料（采用自身左右配對設(shè)計，雙側(cè)腋窩、腹股溝），術(shù)后4、8周標(biāo)本取材后采用放射學(xué)、骨密度（bone mineral density，BMD）、堿性磷酸活性測定（alkaline ph

11、osphatase，ALP）、組織學(xué)觀察及成骨半定量分析評分等方法對各組成骨效能進(jìn)行研究。 結(jié)論： 以COL為載體復(fù)合rhBMP-2和LEP的材料具有高效骨誘導(dǎo)活性，LEP可明顯增強(qiáng)rhBMP-2的骨誘導(dǎo)活性，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)新血管生成和多種細(xì)胞的增殖與分化。該材料具有控制釋放、完全降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，在骨科領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。 第三章、Leptin對hBMSCs生物學(xué)行為干預(yù)的

12、研究。 目的： 研究LEP對體外培養(yǎng)的入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow stromalcells，hBMSCs）增殖與成骨分化的作用，篩選刺激增殖與成骨分化的最佳誘導(dǎo)濃度，并對機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 抽取健康成人骨髓，采用全骨髓培養(yǎng)法，多次消化以純化hBMSCs，取第三代細(xì)胞用于試驗。采用流式細(xì)胞儀檢測與干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，確定細(xì)胞類型；同時在體外對細(xì)胞進(jìn)行向成骨細(xì)胞、軟骨

13、細(xì)胞及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并分別以茜素紅染色、阿利辛藍(lán)染色及油紅O染色進(jìn)行定性鑒定。誘導(dǎo)增殖、成骨分化實驗分為6組，待細(xì)胞貼壁后各組分別加入400 ng/ml LEP、200 ng/mlLEP、100 ng/ml LEP、50ng/ml LEP和（或）100ng/mL BMP（陽性對照）、普通培養(yǎng)基（Common nutrient medium，CNM，陰性對照）各2mL進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)后第2、3、4、5、6d MTT法測定細(xì)胞增殖情況并

14、繪制細(xì)胞增殖曲線，篩選LEP刺激增殖的最佳濃度；于培養(yǎng)第7d行ALP染色、21d行礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色，倒置相差顯微鏡觀察各組染色結(jié)果；于培養(yǎng)后7、14、21d，檢測各組ALP活性、骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平，篩選LEP促成骨分化的最佳濃度；200ng/mLLEP、100ng/mL BMP和CNM組細(xì)胞培養(yǎng)7d后，采用RT-PCR方法檢測成骨相關(guān)基因：核心結(jié)合因子（Core-binding factor α1，Cbfal

15、）、ALP、Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ，COL Ⅰ）、OCN mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)論： 采用全骨髓培養(yǎng)法成功地從健康成人骨髓中分離、培養(yǎng)出hBMSCs，本實驗成功地建立了一整套有關(guān)hBMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定的較簡便的方法，在體外經(jīng)分離傳代培養(yǎng)后細(xì)胞成分較為單一，具有多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本功能特征；LEP可促進(jìn)hBMSCs的增殖和成骨分化，以200ng/ml為最佳誘導(dǎo)濃度。其促hBMSCs成骨分化的