2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、本實(shí)驗(yàn)從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及可溶性共刺激分子(Inducible costimulator,ICOS)兩個(gè)方面對(duì)GVHD進(jìn)行干預(yù)。 第一部分:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性移植物抗宿主病的預(yù)防及治療作用 一、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇、擴(kuò)增和生物學(xué)特性的鑒定: 方法:復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)保存的P5代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,置于mMSCs維持培養(yǎng)基(DMEM-LG+10%FBS)中維持培養(yǎng)。P10代mMSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型

2、表達(dá)。定向誘導(dǎo)mMSCs向成脂肪、成骨和成軟骨分化,鑒定其多向分化潛能。 結(jié)果:P10代mMSCs高表達(dá)CD29、CD44、Sca-1,中度表達(dá)CD13、CD90.2,不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD117、CD45,不表達(dá)FLK-1、MHC-II類(lèi)抗原。P10代mMSCs可向成骨、成脂肪分化。確定其符合MSC的生物學(xué)特性。 二、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)對(duì)急性移植物抗宿主病的預(yù)防及治療作用: 方法:建立以C57BL/6

3、鼠為供體、致死劑量照射的BALB/C鼠為受體的aGVHD動(dòng)物模型,分成6組(各組n=20)。觀測(cè)各組的生存率、體重變化、臨床aGVHD評(píng)分及靶器官損害。 結(jié)果:PBS、GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C組的平均生存天數(shù)分別為(13.5±2.63)天、(11.1±3.96)天、(26.38±7.70)天、(22.69±9.15)天、(22.92±8.15)天,mMSCs各組與GVHD組比較均有顯著性差異(P<0.01),

4、但mMSCs各組之間無(wú)明顯差異(P=0.28);GVHD組體重持續(xù)下降、而mMSCs各組在移植后第8天達(dá)到體重的最低谷,后逐漸恢復(fù)至平臺(tái)期;mMSCs各組的肝臟、結(jié)腸、脾臟病理切片顯示淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥表現(xiàn)明顯輕于GVHD組。 三、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)對(duì)急性移植物抗宿主病干預(yù)的機(jī)制探討: 方法:在移植后的特定時(shí)間點(diǎn),流式檢測(cè)各組小鼠的嵌合率、CFSE標(biāo)記的供體T淋巴細(xì)胞的體內(nèi)增殖、凋亡;ELISA檢測(cè)小鼠外周血上清細(xì)

5、胞因子表達(dá);移植后各組小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞體外ConA刺激再活化,ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清細(xì)胞因子表達(dá)。Ad-EGFP轉(zhuǎn)染mMSCs,輸注入GVHD模型小鼠,熒光共聚焦顯微鏡觀察mMSCs在GVHD靶器官組織中的分布。 結(jié)果: ①mMSCs減少Th1類(lèi)炎癥因子的表達(dá)。 ②mMSCs不影響aGVHD環(huán)境中異基因T淋巴的增殖,但縮短其生存時(shí)間。 ③mMSCs抑制異基因T淋巴細(xì)胞的二次活化功能。 ④m

6、MSCs可能參于aGVHD靶器官的修復(fù)。Ad-EGFP成功轉(zhuǎn)染mMSCs,12小時(shí)轉(zhuǎn)染率為90%。 第二部分:阻斷ICOS-B7h信號(hào)通路對(duì)異基因反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞功能的影響及對(duì)aGVHD的防治作用。 因此我們?cè)O(shè)計(jì)ICOS-Ig融合蛋白阻斷ICOS-B7h通路,探討是否能弱化T淋巴細(xì)胞的異基因反應(yīng)性,從而作為一有效的控制aGVHD的治療手段。 一、建立穩(wěn)定高效表達(dá)ICOS-Ig的CHO細(xì)胞株,純化蛋白,蛋白鑒定方法

7、:pSecTag2/Hygro A-ICOS-Ig質(zhì)粒經(jīng)Not-I、Sfi-I雙酶切鑒定;脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,HygroB 800ug/ml加壓篩選得到高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株,ELISA法及SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)。 二、ICOS-Ig融合蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞異基因反應(yīng)性的影響 方法:建立體外T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增殖培養(yǎng)體系:1、C57BL/6小鼠來(lái)源的脾臟單個(gè)核細(xì)胞以2×105/mL接種,ConA 10ug/mL刺激;2、

8、經(jīng)磁珠分選后得到C57BL/6小鼠脾臟來(lái)源的純CD4淋巴細(xì)胞,以1×105/mL接種作為反應(yīng)細(xì)胞,BABL/C來(lái)源的脾臟單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素滅活后,以2×105/mL作為刺激細(xì)胞,混合培養(yǎng):3、經(jīng)磁珠分選后得到C57BL/6小鼠脾臟來(lái)源的純CD4淋巴細(xì)胞,以1×105/mL接種作為反應(yīng)細(xì)胞,BABL/C骨髓源成熟樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素滅活后,以1×104/mL作為刺激細(xì)胞,混合培養(yǎng)。在上述三種培養(yǎng)體系中,加入不同濃度梯度的ICOS-Ig干

9、預(yù),設(shè)立同濃度的人Ig(h-Ig)作為對(duì)照,每組5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,培養(yǎng)48-72小時(shí)后,CCK-8測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖變化、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)、流式檢測(cè)T淋巴細(xì)胞活化及凋亡。 結(jié)果: ①阻斷ICOS-B7h通路抑制T淋巴細(xì)胞的非特異反應(yīng)性。 ②阻斷ICOS-B7h通路后,CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)同種異基因單個(gè)核細(xì)胞的增殖能力下降。 ③阻斷ICOS-B7h通路后,CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)同種異基因抗原

10、遞呈細(xì)胞的免疫反應(yīng)性下降。 三、ICOS-Ig融合蛋白對(duì)急性移植物抗宿主病的干預(yù)及機(jī)制探討 方法:建立以C57BL/6鼠為供體、致死劑量照射的BALB/C鼠為受體的aGVHD急性移植物抗宿主病動(dòng)物模型,分別在移植0、+2、+4、+8天腹腔注射100ug的ICOS-Ig,以同濃度的人Ig作為對(duì)照。 結(jié)果: ①I(mǎi)COS-Ig干預(yù)可顯著延長(zhǎng)aGVHD小鼠的生存時(shí)間,相比于h-Ig組,ICOS-Ig組的中位生存時(shí)

11、間顯著延長(zhǎng)(10天vs 20天,p=0.0217,n=14);腸道粘膜病變及肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少; ②ICOS-Ig不影響aGVHD環(huán)境中異基因T淋巴細(xì)胞的增殖,但縮短其生存時(shí)間。移植后第3天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟CFSE標(biāo)記的供體T淋巴細(xì)胞增殖狀態(tài)。h-Ig、ICOS-Ig組CD4+CFSE-細(xì)胞群的頻率分別為:(98.88±0.76)%、(99.71±0.27)%,兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;CD8+CFSE-細(xì)胞群的頻

12、率分別為:(98.62±0.63)%、(99.53±0.51)%,兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植后第10天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞凋亡狀態(tài)。h-Ig、ICOS-Ig組(n=5)的CD4+AnnexinV+PI-細(xì)胞群的頻率分別為:(15.72±7.34)%、(22.78±6.94)%,p=0.078;CD8+AnnexinV+PI-細(xì)胞群的頻率分別為:(15.7±9.59)%、(25.92±5.66)%,p=0.032,具有明

13、顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異; ③ICOS-Ig不影響T淋巴細(xì)胞亞群的組成及供體來(lái)源的T淋巴細(xì)胞在aGVHD靶器官中的分布。h-Ig、ICOS-Ig組(n=5)的MHC-I-CD4+/MHC-I+CD8+的比例分別為:26.35±0.07/22.12±0.04,p=0.44。供體來(lái)源的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞在aGVHD靶器官組織(肝、脾)中的絕對(duì)數(shù)值兩組無(wú)明顯差異; ④ICOS-Ig抑制異基因T淋巴細(xì)胞的再次活化功能。移植后第10

14、天分離小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞。體外ConA刺激48小時(shí)后,CCK-8測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖,相對(duì)于h-Ig組,ICOS-Ig組的增殖指數(shù)顯著降低(0.86±0.04 vs 0.69±0.12,P<0.05): ⑤ICOS-Ig減少Th1類(lèi)細(xì)胞因子的分泌,增加Th2類(lèi)細(xì)胞因子的分泌。移植后14天,相比h-Ig組,ICOS-Ig組外周血上清中IFN-γ的分泌明顯減少(562.27±49.97 vs 49.791±2.805,P<0.0

15、1):IL-4的分泌明顯增加:(38.819±27.56vs 456.03±69.63,P<0.05): ⑥ICOS-Ig改變脾臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。移植后14天,Real-time PCR測(cè)定各組小鼠脾臟來(lái)源的T-bet及GATA-3表達(dá)量。相對(duì)于h-Ig組,ICOS-Ig組脾臟的T-bet相對(duì)表達(dá)量減少(5.9±1.22 vs 3.27±1.61,P=0.15);GATA-3的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(2.82±1.08 vs 5.3

16、5±0.48,P=0.03);T-bet/GATA-3的表達(dá)比例明顯減少(1.87±0.65 vs 0.56±0.35,P=0.03)。 結(jié)論:(1)1×105/只(5×108/Kg)的mMSCs不僅可成功預(yù)防GVHD、也具有治療GVHD的作用,但增加mMSCs的數(shù)量(5×105/只)并沒(méi)能進(jìn)一步提高生存率;(2)mMSCs不影響aGVHD環(huán)境中異基因T淋巴的增殖,但縮短其生存時(shí)間;(3)mMSCs減少Th1類(lèi)炎癥因子的表達(dá),抑

17、制異基因T淋巴細(xì)胞的二次活化功能;(4)mMSCs在aGVHD模型中可廣泛分布至腸道粘膜、肺泡及支氣管粘膜上皮、肝臟、腎小管上皮及脾臟實(shí)質(zhì)區(qū),可能參于aGVHD靶器官的修復(fù);(5)成功純化ICOS-Ig融合蛋白,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)阻斷ICOS通路可抑制T淋巴細(xì)胞的非特異反應(yīng)性;通過(guò)縮短活化后的CD4+T淋巴細(xì)胞存活時(shí)間,降低CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)同種異基因單個(gè)核細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞的增殖能力:改變Th細(xì)胞的極化、不影響CD4+T淋巴細(xì)胞的活化功能

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