骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響及作用機制研究.pdf

1、糖尿病的發(fā)病率逐年升高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。目前全球糖尿病患者已經(jīng)達到2.2億人，糖尿病已經(jīng)成為影響人類健康和生活質(zhì)量的重大疾病。糖尿病分為兩種類型，它們一個共同的特點是胰島B細(xì)胞的減少。目前臨床用于β細(xì)胞替代治療的方法主要有胰腺移植和胰島移植，但這兩種方法都存在供體緊缺和免疫排斥的缺點，仍不能大規(guī)模推廣。近年來研究發(fā)現(xiàn)胰島具有再生的潛能，通過促進自身胰島再生來治療糖尿病已經(jīng)成為研究的一個熱點。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓移植能降低糖尿病小鼠血

2、糖，促進糖尿病小鼠胰島的再生。與骨髓細(xì)胞相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)具有擴增能力強、免疫原性低等優(yōu)點，是細(xì)胞移植的理想來源。本研究首先對比了BMSC和骨髓單個核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cell，BMMC)對糖尿病小鼠胰島功能的影響，觀察胰島再生的途徑；然后觀察：BMSC在糖尿病小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸；最后闡明BMSC移植后改善糖尿病小鼠胰島功

3、能的旁分泌機制以及參與胰島再生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響以及胰島再生的途徑。
　　方法：通過鏈脲霉菌素(streptozotocin，STZ)腹腔內(nèi)注射建立小鼠糖尿病模型。隨機分成3組，分別為STZ組(尾靜脈注射PBS)、BMMC組(尾靜脈注射骨髓單個核細(xì)胞)、BMSC組(尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)，移植后

4、每周檢測血糖變化，移植后1周和6周檢測小鼠胰腺形態(tài)學(xué)、Insulin染色，并統(tǒng)計胰島數(shù)目、胰島β細(xì)胞數(shù)目，并通過檢測胰腺組織中Brdt，和胰腺干細(xì)胞的標(biāo)記物(BrdU、PDX-1、Ngn3等)表達情況，了解胰島再生的途徑。
　　結(jié)果：①血糖變化：STZ組小鼠血糖一直呈上升趨勢；移植后第4周，BMMC組小鼠血糖出現(xiàn)顯著下降(19.8±5.8mmol/L)，并持續(xù)下降至第6周(18.7±5.2mmol/L)，分別與STZ組(27.3±

5、1.3mmol/L，27.5±1.1mmol/L，)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.01)；移植后第1周，BMSC組小鼠血糖就出現(xiàn)顯著下降(20.0±7.6 mmol/L)，與STZ組(26.1±3.1mmol/L)和BMMC組(25.2±2.8mmol/L)相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.05)，血糖持續(xù)下降至移植后第6周，此時血糖濃度為16.5±5.7mmol/L，與STZ組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，但與

6、BMMC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。②胰島數(shù)目變化：移植后1周，STZ組小鼠胰島數(shù)目為11.3±4.1個；BMMC細(xì)胞組小鼠胰島數(shù)目為12.8±5.0個，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；而BMSC組小鼠胰島數(shù)目為21.6±7.6個，與STZ組和BMMC組小鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.01)。移植后6周，STZ組小鼠胰島數(shù)目仍較少(15.4±5.3個)，BMMC組小鼠胰島數(shù)增加(23.7±5.4個)，與

7、STZ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，而BMSC組小鼠胰島數(shù)目也顯著增加(26.0±9.4個)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。③胰島B細(xì)胞變化；移植后1周，STZ組小鼠胰島p細(xì)胞數(shù)目較少(143.94±29.2個)，BMMC組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)也較少(155.3±98.9個)，而BMSC組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)較多(320.6±67.6個)，與STZ組和BMMC組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.01)。移植后

8、6周，STZ組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)進一步減少(82.1±33.0個)，而BMMC組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)增加(523.6±150.2個)，與STZ組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，BMSC組胰島β細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多(553.6±242.2個)，與STZ組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。說明BMSC移植能改善糖尿病小鼠的胰島功能，促進胰島B細(xì)胞的再生。④胰腺組織相關(guān)標(biāo)記物的表達：在BMMC組和BMSC組小鼠胰腺組織中發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的增殖，即發(fā)現(xiàn)同時

9、表達Insulin和BrdU的細(xì)胞；還發(fā)現(xiàn)了胰島干細(xì)胞，如同時表達PDX-1和BrdU，但不表達Insulin的細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)Ngn3陽性的細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)同時表達Insulin和Glucagon的細(xì)胞。而對照組未發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞。⑤TUNEL染色：在STZ組小鼠胰腺組織中發(fā)現(xiàn)較多陽性細(xì)胞，即胰島凋亡細(xì)胞增加，而在BMMC組和BMSC組胰島中陽性細(xì)胞較少，即凋亡細(xì)胞較少。
　　結(jié)論：BMSC移植修復(fù)糖尿病小鼠胰島功能的效果優(yōu)于BMMC；BMSC

10、移植促進糖尿病小鼠胰島再生的途徑既包括胰島細(xì)胞自身增殖也包括胰島干細(xì)胞的分化；BMSC移植抑制糖尿病小鼠胰島細(xì)胞凋亡。
　　第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的分布及能否轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞。
　　方法：將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植至糖尿病小鼠體內(nèi)，檢測小鼠胰腺中GFP陽性細(xì)胞的表達

11、以及GFP與胰腺發(fā)育過程中相關(guān)標(biāo)記物的表達情況。
　　結(jié)果：移植后6周，在受體鼠胰腺組織中可見較多的GFP陽性的細(xì)胞，特別是在胰腺的胰島及其周圍，以及胰腺導(dǎo)管周圍。在受體鼠胰腺組織內(nèi)，除了極少數(shù)GFP陽性細(xì)胞表達Insulin(幾千個GFP細(xì)胞中只有2個)，絕大多數(shù)GFP陽性細(xì)胞并不表達Insulin，也未發(fā)現(xiàn)同時表達GFP和胰腺發(fā)育過程中相關(guān)標(biāo)記物如Nestin、Ngn3、PDX-1、NeuroD、Nkx2.2、NKX6.1、P

12、ax4、Pax6的細(xì)胞。
　　結(jié)論：外源性BMSC能遷移至損傷的胰腺組織內(nèi)，特別是胰島和胰腺導(dǎo)管周圍；BMSC移植后血糖的降低并不是由BMSC分化為胰島B細(xì)胞所致。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)糖尿病胰島功能的旁分泌機制研究
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)糖尿病小鼠胰島功能的旁分泌機制及參與胰島再生的信號通路。
　　方法：旁分泌機制實驗：①體內(nèi)實驗：將糖尿病小鼠分為三組：STZ組(尾靜脈注射空培養(yǎng)

13、基)、BMSC組(尾靜脈注射BMSC)、BMSC-CM組(尾靜脈注射BMSC-CM)，分別觀察血糖變化及胰島數(shù)、胰島β細(xì)胞數(shù)變化。②體外實驗：將STZ損傷的小鼠胰島分為2組：STZ組、BMSC-CM組(加入BMSC-CM共培養(yǎng))，了解胰島細(xì)胞形態(tài)及BrdU表達情況。信號通路機制實驗：①體內(nèi)實驗：將糖尿病小鼠分成兩組：STZ組、BMSC組，檢測胰島組織中pAkt、pErk的表達變化。②體外實驗：首先，將STZ損傷的小鼠胰島分成2組STZ組

14、、BMSC-CM組，了解胰島細(xì)胞pAkt、pErk的表達變化。其次，用LY294002、PD98059分別將Akt、Erk信號通路阻斷后，再觀察胰島細(xì)胞形態(tài)及BrdU表達情況。再次，將Akt信號通路阻斷后，觀察pAkt的表達。
　　結(jié)果：旁分泌機制實驗：①血糖變化：STZ組小鼠血糖一直呈上升趨勢。移植后第1周，BMSC組血糖出現(xiàn)顯著下降(20.0±7.6mmol/L)，并一直持續(xù)下降至移植后第6周(16.5±5.7mmol/L)，

15、與STZ組(26.1±3.1mmol/L，27.5±1.1mmol/L)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05，p<0.01)。移植后第1周，BMSC-CM組血糖也出現(xiàn)明顯下降(17.5±4.1 mmol/L)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，與BMSC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，并一直持續(xù)至第6周(11.6±4.9mmol/L)，與STZ組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。②胰島細(xì)胞和β細(xì)胞數(shù)變化：移植

16、后6周，STZ組小鼠胰島數(shù)目仍較少(15.4±5.3個)，胰島β細(xì)胞數(shù)也較少(82.1±33.0個)；BMSC組小鼠胰島數(shù)目增加(26.0±9.4個)，胰島β細(xì)胞數(shù)目也增加(553.6±242.2個)，與STZ組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.01)；BMSC-CM組小鼠胰島數(shù)目較多(32.3±6.2個)，胰島β細(xì)胞數(shù)目也較多(621.0±106.1個)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01，p<0.01)，與B

17、MMC組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。③體外實驗發(fā)現(xiàn)BMSC-CM和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)后，胰島BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。信號通路機制實驗：體內(nèi)、外實驗表明BMSC組小鼠胰島細(xì)胞pAkt、pErk的表達上調(diào)。PI3K阻滯劑LY294002和MEK1阻滯劑PD98059分別阻斷兩條信號通路后，在STZ組、BMSC組、PD98059組胰島中發(fā)現(xiàn)BrdU陽性的細(xì)胞，而在LY294002組和LY294002+PD98059組胰島中未發(fā)現(xiàn)BrdU

18、陽性的細(xì)胞，而且其胰島細(xì)胞團體積較小，這就表明只有阻斷Akt通路才能遏制胰島細(xì)胞增殖。Insulin和BrdU免疫熒光雙染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSC-CM組和PD98059組胰島中同時表達Insulin和BrdU的細(xì)胞較多，即增殖的胰島β細(xì)胞較多。Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)，加入BMSC-CM后pAkt的表達顯著上調(diào)，但加入LY294002后，即使加入BMSC-CM也不能上調(diào)pAkt。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，胰島細(xì)胞和BMSC-C

19、M共培養(yǎng)后，Notch1基因顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：BMSC移植通過旁分泌作用修復(fù)糖尿病小鼠的胰島；BMSC移植通過Akt通路促進糖尿病小鼠胰島的增殖；BMSC移植可能通過Notch通路促進糖尿病小鼠胰島干細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論
　　1.BMSC移植能促進糖尿病小鼠胰島的增殖和胰島干細(xì)胞的分化，效果優(yōu)于BMMC移植。
　　2.BMSC移植通過旁分泌機制修復(fù)糖尿病小鼠的胰島。
　　3.BMSC移植通過Akt通路