人乳腺珠蛋白（hMAM）基因的克隆及其原核表達(dá)的研究.pdf

1、人乳腺珠蛋白(humanmammaglobin，hMAM)屬于子宮珠蛋白(uteroglobin，UG)超家族，是93個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，分子量為10.5kDa。hMAM的生理功能不明，但UG超家族的成員全都是分泌性、少有糖基化的小分子二聚體蛋白，主要在粘膜組織中表達(dá)，結(jié)構(gòu)相似，功能相近，包括調(diào)節(jié)炎癥、結(jié)合類固醇配體等，具有免疫抑制作用。大多數(shù)研究都證實(shí)hMAM基因只在成人乳腺中表達(dá)，在很多乳腺腫瘤中過(guò)度表達(dá)，因而可作為乳腺及乳腺癌特異

2、性標(biāo)志物。hMAM的潛在應(yīng)用包括：乳腺癌淋巴結(jié)、外周血和骨髓轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)；組織來(lái)源未知腫瘤的鑒別；乳腺癌檢測(cè)尤其是早期檢測(cè)，不同部位的hMAM和hMAMmRNA檢測(cè)可能成為原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和隱匿性乳腺癌的標(biāo)志物。同時(shí)hMAM的組織特異性也為它作為治療靶點(diǎn)提供了可能。研究取得的主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)從人乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB453提取總RNA，RT-PCR成功獲得編碼人hMAM的cDNA。乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)

3、兩種hMAMcDNA亞型：hMAM和hMAM(Isoform)，長(zhǎng)度分別為279和270bp，二者相差9個(gè)連續(xù)堿基，其翻譯產(chǎn)物相差3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基(-79～-81，VFM)，二者基因和氨基酸序列匹配度均為96％。cDNA片段分別插入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG,構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)。 2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得了高水平表達(dá)的融合蛋白GST-hM

4、AM和GST-hMAM(ISO)，并確定融合蛋白在BL21中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為：1mmol/LIPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h。SDS-PAGE分析可見，融合蛋白約占細(xì)菌總蛋白的30％，表達(dá)形式為不溶性包涵體，其分子量約為36kDa。 3.大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，包涵體洗滌后變性溶解，經(jīng)反相作用層析初步純化。初步純化的GST融合蛋白經(jīng)超濾置換緩沖溶液、復(fù)性、陰離子交換層析，表達(dá)蛋白得到了有效純化。1g菌體(濕重)可獲得約11mg

5、純度分別為96.5％和95.0％的融合蛋白，得率約為3.5％，純化蛋白濃度為0.53mg/mL。 4.實(shí)驗(yàn)中hMAM(Isoform)與hMAM在包括表達(dá)形式、復(fù)性條件、色譜性狀等方面未見明顯差異。 研究表明，從人乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB453克隆hMAM及其突變體基因、構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)進(jìn)行原核表達(dá)，通過(guò)提取包涵體、變性溶解、復(fù)性、離子交換層析的過(guò)程