大麻素受體在小鼠實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎中的免疫調(diào)節(jié)作用與機(jī)理研究.pdf

1、第一部分：大麻素受體在實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中的動態(tài)表達(dá)
　　目的：觀察大麻素1型受體(cannabinoid receptor 1，CB1R)和大麻素2型受體cannabinoid receptor 2，CB2R)在實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)小鼠不同病程時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)和外周免

2、疫器官的動態(tài)變化。
　　方法：C57B/L6小鼠隨機(jī)分為正常對照組、完全弗氏佐劑組(簡稱CFA組)和EAE組，觀察不同組別小鼠的臨床癥狀和體重變化；取腦、脊髓和脾臟組織，用realtime PCR檢測CB1R和CB2RmRNA表達(dá)：用Western blot檢測CB1R和CB2R蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1、正常小鼠與CFA組小鼠腦和脊髓均有CB1R和CB2RmRNA和蛋白的表達(dá)，且表達(dá)水平在兩組動物中無顯著差異(P>0.05)

3、，但CFA組小鼠脾臟中CB1R、CB2R的表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.05)；2、EAE小鼠在病程不同時期，CNS中CB1R的表達(dá)水平顯著低于相同時點(diǎn)的CFA小鼠(P<0.05)，而CB2R的表達(dá)則顯著高于相同時點(diǎn)的CFA小鼠(P<0.05)；EAE小鼠脾臟中CB1R和CB2R的表達(dá)盡管也顯著高于正常對照組，但與相同時點(diǎn)的CFA小鼠均無顯著性差異(P>0.05)；3、EAE小鼠不同組織中CB1R和CB2RmRNA的表達(dá)水平與蛋白表達(dá)

4、水平一致；CB1R的表達(dá)水平與EAE的發(fā)病程度呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：1、正常小鼠CNS和外周免疫器官均表達(dá)CB1R和CB2R。2、EAE小鼠CNS中CB1R表達(dá)下降，而CB2R升高，推測CB1R神經(jīng)保護(hù)作用的降低和CB2R免疫炎癥調(diào)節(jié)作用的增加可能參與了EAE的發(fā)生和發(fā)展。3、EAE小鼠脾臟中CB1R和CB2R顯著升高沒有疾病特異性，可能與非特異性免疫激活有關(guān)。
　　第二部分：大麻素受體在實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用研究

5、
　　目的：探討CB1R特異性拮抗劑SR141617A(SR1)和CB2R特異性拮抗劑SR144528(SR2)對EAE病程發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)理。
　　方法：EAE小鼠隨機(jī)分為空白對照組，溶劑對照組，SR1干預(yù)組和SR2干預(yù)組。觀察不同組別小鼠的臨床癥狀和體重變化：取腦、脊髓和脾臟組織，用realtimePCR技術(shù)檢測CB1R和CB2RmRNA表達(dá)；用Western blot檢測CB1R和CB2R蛋白表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附法(

6、Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測細(xì)胞因子和趨化因子的水平；應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)法檢測脾臟特異性T細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果：1、SR1干預(yù)的EAE小鼠臨床評分在發(fā)病早期顯著高于溶劑對照組，并伴隨體重顯著降低(P<0.05)；SR2干預(yù)的EAE小鼠臨床評分

7、在發(fā)病高峰期后顯著高于溶劑對照組，并伴隨體重顯著降低(P<0.05)；2、SR1顯著抑制了CB1R表達(dá)，但卻促進(jìn)了CB2R表達(dá)；SR2在抑制CB2R表達(dá)的同時促進(jìn)了CB1R的表達(dá)；3、SR1可上調(diào)EAE發(fā)病高峰期腦和脊髓組織以及脾臟抗原特異性T細(xì)胞致炎因子(IFN-γ、IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α)和趨化因子MCP-1的水平；4、SR2可上調(diào)EAE發(fā)病高峰期腦、脊髓和脾臟中抗原特異性T細(xì)胞Th1/Th17細(xì)胞因子以及趨化

8、因子MCP-1和CX3CL1水平，下調(diào)Th2細(xì)胞因子水平；5、SR1干預(yù)的EAE小鼠脾臟抗原特異性T細(xì)胞增殖在發(fā)病高峰期顯著高于溶劑對照組(p<0.05)，而SR2干預(yù)的EAE小鼠脾臟抗原特異性T細(xì)胞增殖在發(fā)病高峰期和緩解期均顯著高于溶劑對照組(p<0.05)。
　　結(jié)論：1、SR1使EAE發(fā)病提前，但不加重EAE發(fā)病高峰期之后的臨床癥狀；2、SR2顯著加重EAE發(fā)病高峰期之后的臨床表現(xiàn)，疾病呈現(xiàn)不易緩解的趨勢；3、SR1和SR2

9、均可導(dǎo)致腦、脊髓和脾臟組織中CB1R/CB2R的表達(dá)失衡；4、SR1和SR2可分別上調(diào)炎性細(xì)胞因子和趨化因子以及抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)，SR2可下調(diào)IL-10產(chǎn)生。
　　第三部分：EAE小鼠病程中神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞大麻素受體水平的動態(tài)變化
　　一、原代神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞大麻素受體的表達(dá)
　　目的：觀察原代神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R和CB2R的表達(dá)。
　　方法：取孕18天胎鼠的海馬培養(yǎng)神經(jīng)元，取24小時

10、新生小鼠的皮層培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。用realtime PCR檢測CB1R和CB2RmRNA的表達(dá)，用Western blot檢測CB1R和CB2R蛋白的表達(dá)，用熒光免疫組織化學(xué)方法觀察不同細(xì)胞CB1R和CB2R的表達(dá)。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞均有CB1R和CB2R的表達(dá)，但星形膠質(zhì)細(xì)胞僅有CB2R表達(dá)。
　　結(jié)論：不同神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)不同類型的CBR。
　　二、EAE小鼠病程中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞大麻

11、素受體的表達(dá)變化
　　目的：觀察CBR拮抗劑干預(yù)后CB1R和CB2R在EAE小鼠病程中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化，探討大麻素受體在EAE發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：C57B/L6小鼠隨機(jī)分為正常對照組、CFA組和EAE組。其中，EAE小鼠隨機(jī)分為溶劑對照組，SR1干預(yù)組和SR2干預(yù)組。用熒光免疫組織化學(xué)方法分別雙染不同組別小鼠神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和CB1R/CB2R；用Image-ProPlus6.0軟件分析E

12、AE不同時期CB1R和CB2R陽性細(xì)胞數(shù)的變化。
　　結(jié)果：1、CB1R主要在神經(jīng)元上表達(dá)，小膠質(zhì)細(xì)胞有少量表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)；CB2R主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，神經(jīng)元有少量表達(dá)；2、與相應(yīng)時點(diǎn)的CFA小鼠比較，EAE小鼠神經(jīng)元CB1R的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，星形膠質(zhì)細(xì)胞CB2R的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R與CB2R的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；3、SR1顯著抑制神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)

13、胞CB1R的表達(dá)，但上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞CB2R的表達(dá)；SR2顯著抑制神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞CB2R的表達(dá)，但上調(diào)神經(jīng)元CB1R的表達(dá)。
　　結(jié)論：1、不同細(xì)胞表達(dá)不同類型的CBR；2、EAE不同時期不同細(xì)胞類型的CBR表達(dá)變化存在差異；3、SR1可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R和CB2R表達(dá)失衡；SR2可誘導(dǎo)神經(jīng)元CB1R和CB2R表達(dá)失衡；4、本研究結(jié)果提示CB1R和CB2R在EAE發(fā)生發(fā)展中可能分別發(fā)揮不同的作用。
　　第

14、四部分：大麻素受體在激活態(tài)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥調(diào)節(jié)中的作用
　　目的：探討CBR在激活態(tài)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法：用IFN-γ刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，將激活后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為vehicle組，SR1干預(yù)組，SR2干預(yù)組，WIN-2(CBR非選擇性激動劑)組，WIN-2+SR1組和WIN-2+SR2組。用realtime PCR檢測CB1R和CB2RmRNA表達(dá)，Western blot檢測

15、CB1R和CB2R蛋白表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞因子和趨化因子的水平；MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)果：1、IFN-γ刺激可明顯上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R和CB2RmRNA和蛋白的表達(dá)；WIN-2可進(jìn)一步刺激CB1R和CB2R的表達(dá)增加(P<0.05)；2、比較于溶劑對照組，SR1顯著上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IFN-γ、IL-6、TNF-α的水平(P<0.05)，下調(diào)IL-17的濃度(P<0.05)，促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮

16、(nitricoxide，NO)釋放(P<0.05)：3、比較于溶劑對照組，SR2顯著上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Th1/Th17細(xì)胞因子和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，下調(diào)Th2細(xì)胞因子和趨化因子CX3CL1的水平(P<0.05)，促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和NO釋放(P<0.05)。
　　結(jié)論：SR1和SR2可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和/或促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO等環(huán)節(jié)參與調(diào)節(jié)了Th1/Th17/Th2細(xì)胞因子、炎性因子和趨化

17、因子的水平。
　　結(jié)論：
　　1、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)CB1R和CB2R，星形膠質(zhì)細(xì)胞只表達(dá)CB2R。
　　2、EAE病程中，腦、脊髓組織CB1R(神經(jīng)保護(hù))表達(dá)減少，而CB2R(免疫調(diào)節(jié))表達(dá)增多，可能與EAE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　3、SR1導(dǎo)致EAE小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞CB1R/CB2R表達(dá)失衡，而SR2導(dǎo)致神經(jīng)元CB1R/CB2R表達(dá)失衡；CB1R和CB2R在EAE發(fā)生發(fā)展中可能分別發(fā)揮不同作用。