瘦素通過調(diào)控T細胞平衡在實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：探討瘦素(leptin)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病的促進作用及其對T細胞平衡的調(diào)控機制。
　　方法：將45只健康雌性C57BL/6小鼠隨機分為:正常對照組、EAE對照組、leptin處理組，每組15只。EAE對照組和leptin處理組采用MOG35-55加完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠制作EAE模型，正常對照組給予注射等量的生理鹽水和CFA。于造模當天和造模后48小時，分別將0.2ml百日咳毒素溶

2、液（200ng/只）注入每只小鼠腹腔內(nèi)。自造模當日起，leptin處理組每日兩次（9點和18點）給予腹腔注射重組leptin（0.5μg/g），正常對照組及EAE對照組分別每日兩次給予腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)10天。EAE對照組、leptin處理組小鼠連續(xù)三天癥狀評分無加重、出現(xiàn)四肢癱瘓或死亡可作為發(fā)病的高峰期，在高峰期時處死小鼠，正常對照組及未發(fā)病小鼠飼養(yǎng)4周后處死，留取小鼠腦和脊髓組織、眶周靜脈血、脾臟。指標檢測：記錄各組小鼠發(fā)病

3、情況、高峰期的主要癥狀、潛伏期、進展期及高峰期神經(jīng)功能障礙評分；HE染色觀察小鼠腦和脊髓的病理改變，并對其進行評分；流式細胞儀檢測小鼠脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17細胞占CD4+T細胞比例；ELISA法檢測各組小鼠外周血血清IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1含量；對EAE對照組及l(fā)eptin處理組各項指標進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：⑴各組小鼠發(fā)病情況、高峰期主要癥狀、潛伏期、進展期及高峰期

4、神經(jīng)功能障礙評分的變化:正常對照組未發(fā)病，EAE對照組有13只小鼠發(fā)病，leptin處理組全部發(fā)病;與EAE對照組比較，leptin處理組發(fā)病高峰期主要癥狀更重，潛伏期縮短(P＜0.01)，進展期延長(P＜0.01)，高峰期神經(jīng)功能障礙評分增加(P＜0.05)。⑵各組小鼠腦和脊髓組織病理改變:正常對照組小鼠腦和脊髓無異常，EAE對照組及l(fā)eptin處理組可見組織疏松腫脹，血管周圍白質(zhì)明顯的脫髓鞘改變，血管周圍尤其是小靜脈的周圍可見炎性細

5、胞浸潤，呈典型的“袖套”樣改變;與EAE對照組比較，leptin處理組小鼠腦和脊髓組織病理評分增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。⑶各組小鼠血清中IFN-γ、IL-4的含量及IFN-γ/IL-4比值變化:與正常對照組比較，EAE對照組、leptin處理組小鼠血清IFN-γ含量明顯升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）;與EAE對照組比較，leptin處理組小鼠血清IFN-γ含量

6、明顯升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。⑷各組小鼠血清中IL-17、TGF-β1的含量變化:與正常對照組比較，EAE對照組、leptin處理組小鼠血清IL-17含量均升高，TGF-β1含量均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01);與EAE對照組比較，leptin處理組小鼠血清IL-17含量升高，TGF-β1含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。⑸各組小鼠

7、脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17細胞占CD4+T細胞比例的變化:與正常對照組比較，EAE對照組、leptin處理組小鼠脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的比例均明顯降低，Th17細胞比例均升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）;與EAE對照組比較，leptin處理組小鼠脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的比例降低，Th17細胞比例升高，差異

8、均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。⑹相關(guān)性分析：EAE對照組和leptin處理組小鼠發(fā)病潛伏期與血清IL-4、TGF-β1的含量、脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞比例呈正相關(guān)(P均＜0.01);與血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾細胞懸液中Th17比例呈負相關(guān)（P均＜0.01）；EAE對照組和leptin處理組小鼠發(fā)病進展期與血清IL-4、TGF-β1的含量、脾細胞懸液中CD4+CD

9、25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞比例呈負相關(guān)（P均＜0.01）;與血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾細胞懸液中Th17比例呈正相關(guān)（P均＜0.01）；EAE對照組和leptin處理組小鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分與血清IL-4、TGF-β1的含量、脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞比例呈負相關(guān)（P均＜0.01）;與血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾細胞懸液中T

10、h17比例呈正相關(guān)（P均＜0.01）；EAE對照組和leptin處理組小鼠腦和脊髓組織病理評分與血清IL-4、TGF-β1的含量、脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞比例呈負相關(guān)（P均＜0.01）;與血清IFN-γ、IL-17、IFN-γ/IL-4、脾細胞懸液中Th17比例呈正相關(guān)（P均＜0.01）。
　　結(jié)論：①采用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型，EAE小鼠的神經(jīng)功能障礙明顯，

11、腦和脊髓病理切片可見血管周圍明顯炎性細胞浸潤及白質(zhì)脫髓鞘改變，說明造模成功。②EAE小鼠體內(nèi)存在著T細胞平衡紊亂。EAE小鼠發(fā)病高峰期血清中IFN-γ及IL-17含量升高，IL-4、TGF-p1含量降低，脾細胞懸液中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例下降，Th17細胞比例升高，說明EAE內(nèi)存在Th1/Th2平衡及Th17/Treg平衡漂移。③Leptin可以縮短EAE小鼠發(fā)病潛伏期、延長進展期、增加神經(jīng)功能障礙評分、加重腦和