復(fù)方丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛和氨氯地平對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊消退和穩(wěn)定作用的研究.pdf

1、背景：冠心病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherossclerosis，AS)。研究表明AS是一個(gè)穩(wěn)定期和不穩(wěn)定期交替的非線性過程，這一過程取決于斑塊的易損性。易損斑塊(Vulnerable Plaque)可導(dǎo)致斑塊破裂和血栓形成，臨床上表現(xiàn)為急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute CoronarySyndrome，ACS)。因此，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化早期診斷、穩(wěn)定和消退斑塊具有重要的臨床意義。 已經(jīng)證實(shí)

2、AS是一個(gè)多種致病因素導(dǎo)致的血管壁發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的慢性炎癥過程。炎性因子標(biāo)志物對(duì)ACS的診斷作用引起了國內(nèi)外許多學(xué)者的關(guān)注，如：高敏C反應(yīng)蛋白(hsC-RP)、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)、細(xì)胞血管間黏附因子-1(VCAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等。晚近，關(guān)于妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的研究發(fā)現(xiàn)，PAPP-A與斑塊的炎性活動(dòng)存在相關(guān)性，有可能作為斑塊炎性活動(dòng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。 以往的研究表明，他汀類和ACEI

3、類藥物具有穩(wěn)定斑塊的作用。近年來，隨著臨床研究結(jié)果的公布β-受體阻滯劑和鈣拮抗劑對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的消退作用引起很多學(xué)者關(guān)注，但是具體作用機(jī)制尚不完全清楚。研究證實(shí)中藥復(fù)方丹參滴丸可以影響脂質(zhì)的代謝，但其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定和消退的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。因此，本研究擬將復(fù)方丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛和氨氯地平用于兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中，觀察這些藥物對(duì)斑塊穩(wěn)定和消退的療效并探討其分子生物學(xué)機(jī)制。 目的： 1．觀察復(fù)方

4、丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛、氨氯地平對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的消退和穩(wěn)定作用并探討其分子生物學(xué)機(jī)制。 2．探討新型炎性因子PAPP-A在預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊中的作用。 研究方法： 1．模型的建立：60只雄性新西蘭純種大白兔，應(yīng)用球囊損傷腹主動(dòng)脈，高膽固醇(1％)飼養(yǎng)12周。12周末，隨機(jī)分成六組，分別為小劑量復(fù)方丹參滴丸組(5粒/天/只)、大劑量復(fù)方丹參滴丸組(10粒/天/只)、美托洛爾組(25毫克/天/只

5、)、卡維地洛組(15毫克/天/只)、氨氯地平組(5毫克/天/只)、自然消退組，同時(shí)改為普通飲食。24周末各組分別在腹主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處轉(zhuǎn)染100μl 2.245×10<'9>pfu/ml的Ad-p53重組載體。25周末，給予各組實(shí)驗(yàn)兔中國斑點(diǎn)蝰蛇毒(Chinese Russell's viper venom，CRVV)以及組胺進(jìn)行藥物觸發(fā)，以促進(jìn)斑塊破裂。 2．血液生化指標(biāo)及炎性因子的檢測(cè)：各組實(shí)驗(yàn)兔分別于實(shí)驗(yàn)開始、12周

6、末和24周末，于清晨空腹稱重后，經(jīng)腹壁靜脈采血，檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。于實(shí)驗(yàn)開始、12周末和25周末測(cè)量血液中一氧化氮(NO)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定hsC-RP、PAPP-A的水平。 3．高頻超聲檢查：各組實(shí)驗(yàn)兔分別于實(shí)驗(yàn)開始、12周末和25周末應(yīng)用體表超聲檢測(cè)腹主動(dòng)脈收縮

7、期內(nèi)徑(Ds)、內(nèi)膜-中層厚度(IMT)、腹主動(dòng)脈血流峰值速度(Vp)、血流剪切率(SR)和聲學(xué)密度(AIIc％)。 4．血管內(nèi)超聲檢查：各組實(shí)驗(yàn)兔分別于24周末和處死前應(yīng)用血管內(nèi)超聲技術(shù)測(cè)量血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)和斑塊面積(PA)，同時(shí)根據(jù)PA和EEMA計(jì)算管腔面積狹窄百分比(LAS％)。 5．組織病理學(xué)檢測(cè)：觀察基因轉(zhuǎn)染部位斑塊破裂及血栓形成的發(fā)生率，測(cè)量易損斑塊處血管重構(gòu)情況。利用HE和

8、油紅O染色，觀察斑塊的形態(tài)學(xué)特征，鏡下測(cè)量纖維帽及內(nèi)中膜的厚度；masson染色觀察斑塊內(nèi)部膠原纖維分布狀況；應(yīng)用妊娠血漿相關(guān)蛋白A(PAPP-A)、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)、細(xì)胞血管間黏附因子-1(VCAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制物(TiMP-1)的單克隆抗體、RAMll單克隆抗體和α-actin單克隆抗體對(duì)腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行組織免疫組織化學(xué)染色，以明確斑塊處各個(gè)炎性因子的表達(dá)以及

9、巨嗜細(xì)胞和平滑肌激動(dòng)蛋白的分布情況。電鏡觀察斑塊內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。 6．實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的mRNA表達(dá)水平。 7．免疫印跡(Westem blot)技術(shù)：檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。 8．斑塊易損性的危險(xiǎn)性分析：Logistic

10、回歸分析對(duì)斑塊破裂組和未破裂組的體重、血清學(xué)指標(biāo)、體表超聲指標(biāo)、AD值、IVUS測(cè)值等指標(biāo)分析進(jìn)行多變量Logistic回歸分析，以篩選斑塊易損性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。 9．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用SPSSl3.0分析軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)及方差分析，三組以上均數(shù)有顯著性差異時(shí)，采用兩兩比較q檢驗(yàn)；變量之間的相關(guān)關(guān)系采用直線回歸相關(guān)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．模型的建立：

11、60只新西蘭大白兔經(jīng)過球囊拉傷以及高脂飲食(1％)12周后，共有8只動(dòng)物意外死亡。有52只新西蘭大白兔進(jìn)入藥物干預(yù)階段，小劑量復(fù)方丹參滴丸組有9只，大劑量復(fù)方丹參滴丸組9只，卡維地洛組9只，美托洛爾組8只，氨氯低平組9只，自然消退組8只。24周術(shù)，各組實(shí)驗(yàn)兔的存活情況為：小劑量復(fù)方丹參滴丸組8只，大劑量復(fù)方丹參滴丸組9只，卡維地洛組7只，美托洛爾組8只，氨氯地平組8只，自然消退組7只。死亡原因分別為：麻醉意外、腹瀉、感染或者原因不明。

12、 2．各組實(shí)驗(yàn)兔體重：12周末實(shí)驗(yàn)兔體重比基礎(chǔ)狀態(tài)增加(P<0.01)，24周術(shù)各組體重與12周末比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3．血脂水平：與自然消退組比較，氨氯地平組、大劑量復(fù)方丹參滴丸組、卡維地洛組和美托洛爾組TC和LDL-C顯著降低(P<0.05)，小劑量復(fù)方丹參滴丸組有降低趨勢(shì)，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：TG降低僅氨氯地平組降低達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；大劑量復(fù)方丹參滴丸組和氨氯地平組HDL-

13、C升高達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，美托洛爾組HDL-C降低達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4．血液指標(biāo)：與自然消退組相比較，各治療組hsC-RP和MDA都有不同程度降低(P<0.05)；SOD和NO各組都有不同程度的升高(P<0.05)，其中以大劑量復(fù)方丹參滴丸組最為明顯。 5．體表超聲：與自然消退組比較，各治療組僅有小劑量復(fù)方丹參滴丸組IMT未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低(P>0.05)，降低幅度由大到小依次為氨氯地

14、平組、卡維地洛組、大劑量復(fù)方丹參滴丸組、美托洛爾組、小劑量復(fù)方丹參滴丸組和自然消退組：美托洛爾組和卡維地洛組Vp降低達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AIIc％各組升高均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以美托洛爾組升高最明顯；SR僅美托洛爾組降低達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而復(fù)方丹參滴丸組由增加的趨勢(shì)，其中小劑量復(fù)方丹參滴丸組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6．血管內(nèi)超聲：與自然消退組比較，各治療組LAS％明顯下降(P<0.

15、05)。藥物觸發(fā)后，自然消退組斑塊破裂4例，破裂率57％；小劑量丹參滴丸組破裂3例，破裂率37％；大劑量丹參滴丸組2例，破裂率22％；美托洛爾組2例，破裂率25％，氨氯地平組2例，破裂率25％；卡維地洛組1例，破裂率14％。 7．病理學(xué)結(jié)果：與自然消退組比較，各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、FIMP-l和RAMll的表達(dá)均減少，而a-actin的表達(dá)增加；各治療組油紅O著色比自然消退組淺；與自然消退組比較，

16、各個(gè)治療組纖維帽的厚度都有不同程度的升高(P<0.05)由大到小依次為美托洛爾組、大劑量復(fù)方丹參滴丸組、小劑量復(fù)方丹參滴丸組、氨氯地平組、卡維地洛組和自然消退組；內(nèi)中膜厚度不同程度的減少(P<0.05)。 8．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：與自然消退組比較，各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達(dá)都有不同程度的減少(P<0.01)。 9．免疫印跡(Western blot)檢測(cè)：與自然消退組比較，

17、各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、lIMP-1都有不同程度的減少。 10.PAPP-A相關(guān)性分析：PAPP-A與血液hsC-RP、血管內(nèi)超聲LAS％以及腹主動(dòng)脈IMT相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R<'2>分別為0.424、0.112和0.339，其P值均小于0.01。 11.斑塊易損性的危險(xiǎn)性分析：Logistic回歸結(jié)果顯示IVUS測(cè)值PA，血清指標(biāo)PAPP-A和hsC-RP，以及斑塊的IMT與斑塊破裂關(guān)系密切

18、，是預(yù)測(cè)斑塊易損性的重要指標(biāo)。 結(jié)論 1．在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊兔模型中，氨氯地平、美托洛爾、卡維地洛和復(fù)方丹參滴丸可以起到穩(wěn)定和消退斑塊的作用，以氨氯地平作用最佳。 2．斑塊內(nèi)脂質(zhì)的減少、巨嗜細(xì)胞分布減少、抑制氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達(dá)是四種藥物消退實(shí)驗(yàn)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要機(jī)制；調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎性反應(yīng)、減少血流速度、調(diào)節(jié)血流剪切率是藥物穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要機(jī)制。 3．復(fù)方丹參滴丸主要通過調(diào)

19、節(jié)血脂、抑制氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達(dá)穩(wěn)定和消退動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。美托洛爾和卡維地洛主要通過降低血流剪切率、巨嗜細(xì)胞分布減少和調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)穩(wěn)定和消退動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。氨氯地平作用較廣泛，調(diào)節(jié)血脂、減少巨嗜細(xì)胞的分布、抑制氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達(dá)。 4．高頻超聲檢查可作為動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的變化、識(shí)別斑塊破裂的可靠性方法。 5．PAPP-A與IMT、hsC-RP以及LAS％相關(guān)，可以作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的