外源性磷酸肌酸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性的作用的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是許多心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)。
　　磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是一種高能磷酸化合物，在體內(nèi)可為ATP循環(huán)提供磷酸基團(tuán)，參與能量運(yùn)輸，是機(jī)體內(nèi)最直接、最主要的供能物質(zhì)之一。目前PCr在臨床上主要用于心臟手術(shù)時(shí)加入心臟停搏液中，以保護(hù)心肌缺血狀態(tài)下的心肌代謝異常。許多研究表明，PCr除了在心肌保護(hù)中具有顯著作用外，還因其具有的抗

2、氧化作用和膜穩(wěn)定作用等可以輔助治療多種心血管疾病，如心力衰竭，心肌梗死，腦缺血等。在體外藥理實(shí)驗(yàn)中表明PCr可以通過阻滯細(xì)胞周期從而抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。
　　發(fā)表于2012年美國一項(xiàng)專利給藥理研究釋放了一個(gè)有意思的信號(hào)，它指出磷酸肌酸可以在體外溶解斑塊，那么磷酸肌酸是否有預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其可能的作用機(jī)制又是什么。本研究首次通過體內(nèi)體外模擬AS疾病，發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸可以有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，并且使粥樣

3、斑塊趨于穩(wěn)定，為患有心腦血管疾病合并動(dòng)脈粥樣硬化的患者用藥提供了新的選擇。
　　目的:
　　1、觀察外源性PCr對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和穩(wěn)定性的作用。
　　2、初步探討外源性PCr對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病治療作用的機(jī)理，及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。
　　方法:
　　1、動(dòng)物模型建立與分組
　　7-8周雄性ApoE-/-小鼠，全程高脂飼料喂養(yǎng)（含0.25％膽固醇和15％脂肪）12周，于高脂四周后，頸動(dòng)脈分離并

4、套管，縫合后繼續(xù)喂養(yǎng)八周，建立動(dòng)脈粥樣硬化早、晚期模型。高脂喂養(yǎng)八周之后，將小鼠隨機(jī)分為五組:①陰性對(duì)照組(0.9％NaCl，0.1ml/10g/d);②低劑量磷酸肌酸組(150mg/kg/d);③中劑量磷酸肌酸組(300mg/kg/d);④高劑量磷酸肌酸組(600mg/kg/d)⑤陽性對(duì)照組（辛伐他汀50mg/kg/d）。其中生理鹽水與磷酸肌酸均為尾靜脈注射給藥，辛伐他汀混于食物中喂食。
　　2、體重、血清指標(biāo)檢測(cè)
　　小

5、鼠處死前稱量體重并取血，測(cè)定血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白四項(xiàng)指標(biāo)。
　　3、組織病理學(xué)檢測(cè)與免疫組化染色
　　取小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行大體油紅O染色，用Image-Pro Plus6.0定量陽性染色面積百分比得到主動(dòng)脈斑塊大小;主動(dòng)脈根及頸動(dòng)脈進(jìn)行冰凍組織切片，進(jìn)行HE染色，觀察斑塊大小;切片進(jìn)行油紅O染色，MOMA-2抗體染色，α-SMA抗體染色，天狼猩紅染色，觀察主動(dòng)脈根斑塊中脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以

6、及膠原的含量，肌酸斑塊的易損指數(shù)。主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行DHE染色，觀察斑塊的活性氧含量。
　　4、分子生物學(xué)檢測(cè)
　　取小鼠主動(dòng)脈，western blot法測(cè)定MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平;使用BD公司CBA試劑盒和流式細(xì)胞測(cè)定儀檢測(cè)IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)含量;qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和MMP-9的mRNA水平含量;明膠酶譜法

7、檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶pro-MMP-2，MMP-2，pro-MMP-9和MMP-9的活性。
　　5、探究PCr對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制
　　CCK-8檢測(cè)方法確定給藥濃度為20mM。以氧化性低密度脂蛋白(oxLDL，100μg/ml)為刺激物體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化模型，Western blot法測(cè)定給予藥物刺激之后正常組、正常加藥組、oxLDL處理組、oxLDL處理加藥組NOX2的蛋白表達(dá);qRT-PCR法測(cè)定四組細(xì)胞炎性因子的m

8、RNA水平;DCFH-DA與DHE染色分別標(biāo)定內(nèi)皮細(xì)胞中過氧化氫與超氧陰離子，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧的含量;檢測(cè)PCr對(duì)MAPK不同家族激酶的作用。
　　結(jié)果:
　　1、與NS組相比PCr各劑量組可以顯著降低ApoE-/-小鼠的血清中甘油三酯水平;中劑量組和高劑量組可以降低低密度脂蛋白水平;中劑量組可以降低總膽固醇水平;各組小鼠血清中高密度脂蛋白水平無明顯差異。
　　2、與NS組相比，PCr各劑量組均可以

9、降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈總體斑塊面積，主動(dòng)脈弓斑塊面積和主動(dòng)脈根斑塊面積，降低斑塊中ROS的含量，提高斑塊的穩(wěn)定性。
　　3、蛋白檢測(cè)中，與NS組相比，磷酸肌酸中劑量和高劑量降低了ApoE-/-小鼠MMP-9蛋白含量(P＜0.05);各劑量對(duì)MMP-2蛋白的含量無顯著影響;中、高劑量可顯著降低IL-6和TNF-α蛋白水平(P＜0.05);高劑量可降低MCP-1蛋白水平(P＜0.05);各用藥組對(duì)IL-10蛋白水平作用不明顯。<

10、br>　　mRNA水平檢測(cè)中，與NS組相比，磷酸肌酸中、高劑量可顯著降低IL-6與TNFα的mRNA水平，升高IL-10和TIMP-1的mRNA水平;高劑量可顯著降低MCP-1的mRNA水平(P＜0.05)。
　　明膠酶譜法檢測(cè)MMPs活性可以看到，與NS組相比，磷酸肌酸各劑量組pro-MMP-2和MMP-2活性變化不明顯，但各劑量均可顯著降低pro-MMP-9和MMP-9的活性。
　　4、PCr可以減少oxLDL刺激的內(nèi)皮