受體相關(guān)蛋白在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和腹主動(dòng)脈瘤中的作用.pdf

1、受體相關(guān)蛋白(Receptorassociatedprotein，RAP)在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)，它可以和多種蛋白結(jié)合，其中包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP1)、脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase，LPL)、極低密度脂蛋白受體(verrlowdensitylipoproteinreceptor，VLDLR)和糖蛋白330(glycopr

2、otein330/megalin)。相關(guān)的研究表明，RAP可以在上述蛋白合成分泌過程中，與這些蛋白的前體結(jié)合，預(yù)防其在蛋白成熟前與其它細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合。RAP基因的缺失可能導(dǎo)致上述蛋白表達(dá)減低。因此，RAP也被稱為相關(guān)蛋白的分子伴侶，和RAP相關(guān)的蛋白中，LRP1具有對(duì)血管疾病的保護(hù)作用，如LRP1在血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中的表達(dá)缺失可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生；而LPL在巨噬細(xì)胞中表達(dá)缺失卻可以減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，盡管上述蛋

3、白，尤其是LRP1，在心血管疾病中的作用已經(jīng)做了廣泛深入的研究，但關(guān)于RAP在心血管疾病中作用的研究，目前仍然是一片空白。本課題將采用RAP基因敲除小鼠，探討RAP在血管緊張素II(AngII)誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化和腹主動(dòng)脈瘤(AAAs)中的作用。 RAP基因敲除小鼠購買自Jackson實(shí)驗(yàn)室。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均和C57BL6小鼠雜交繁殖10次以上，通過滲透性微泵慢性持續(xù)輸注AngII28天，誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化和腹主動(dòng)脈瘤病變的發(fā)生，血

4、漿膽固醇濃度和脂蛋白的分布通過酶反應(yīng)試劑盒和快速蛋白液相法(FastProteinLiquidChromatography,FPLC)檢測(cè)。Kent8尾動(dòng)脈測(cè)壓系統(tǒng)測(cè)量小鼠尾動(dòng)脈收縮壓。顯微鏡直視下，通過測(cè)量主動(dòng)脈弓內(nèi)膜表面動(dòng)脈粥樣硬化病變面積來量化動(dòng)脈粥樣硬化(enfacemeasurement)。采用Image-Pro軟件量取腹主動(dòng)脈腎動(dòng)脈以上段最大的外徑作為AAAs的評(píng)估指標(biāo)。動(dòng)脈外徑大于正常值(約0.8mm)50％，定義為AAA

5、s。 首先，鼠系和年齡相當(dāng)?shù)男坌孕∈?RAP+/+，n=11，RAP-/-，n=10)予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，并通過滲透性微泵輸注AngII(1000ng/kg/min)28天。結(jié)果表明，RAP基因敲除并不影響小鼠的體重和血總膽固醇水平。AngII輸注同時(shí)增加兩組小鼠尾動(dòng)脈收縮壓(RAP+/+，177±7mmHg，RAP-/-，170±5mmHg，P=NS)。RAP基因敲除不增加AngII誘導(dǎo)的AAAs的發(fā)生。 然后，鼠系和年

6、齡相當(dāng)?shù)腖DL受體基因敲除的雄性小鼠，同時(shí)分別是RAP+/+(n=20)或RAP-/-(n=17)小鼠予以高脂飲食。我們觀察高脂血癥時(shí)，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和AAAs的變化。所有小鼠輸注500ng/kg/min的AngII28天。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)過程中兩組小鼠沒有明顯的體重差別。AngII輸注均升高兩組小鼠的尾動(dòng)脈收縮壓(RAP+/+：171±6mmHg；RAP-/-:165±5mmHg；P=NS).在LDL受體基因敲除的背景下，RAP基因敲

7、除顯著升高血漿膽固醇濃度(RAP+/+:1122±40；RAP-/-：1500±56mg/dl；P<0.001)。FPLC和非線性擬合分析表明，RAP基因缺失導(dǎo)致了VLDL(RAP+/+:484±22；RAP-/-：713±55mg/dl；P=0.001)和IDL/LDL(RAP+/+：566±25；RAP-/-：757±42mg/dl；P<0.001)濃度的顯著升高，與此同時(shí)，降低了HDL(RAP+1+：75±3；RAP-/-：63±

8、4mg/dl；P=0.028)的濃度。盡管RAP基因敲除引起了上述致動(dòng)脈粥樣硬化性血脂成分改變，RAP基因敲除小鼠主動(dòng)脈弓的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積百分比，與RAP+/+小鼠相比，卻顯著降低(RAP+1+:：18.28±2.24％；RAP-/-:11.74±0.99mg/dl；P=0.041)。而兩組小鼠腹主動(dòng)脈外徑?jīng)]有顯著差異(1.48±0.30versus1.25±0.15mm，P=NS)。 為區(qū)分是骨髓來源的細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)

9、胞)還是血管壁中的原有的細(xì)胞(resident細(xì)胞，如血管平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞)中的RAP基因，發(fā)揮的對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈瘤的調(diào)控作用，我們進(jìn)行骨髓移植實(shí)驗(yàn)。LDLR基因敲除小鼠以非致死劑量進(jìn)行骨髓照射后，予以RAP+/+(n=24)或RAP-/-(n=25)骨髓細(xì)胞進(jìn)行骨髓重建4周。骨髓重建后小鼠予高脂喂養(yǎng)并輸注500ng/kg/minAngII28天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨髓來源的細(xì)胞特異性RAP基因缺失對(duì)小鼠的體重和血漿膽固醇沒有顯著影

10、響。AngII同時(shí)升高兩組小鼠尾動(dòng)脈收縮壓(RAP+1+：168±3mmHg；RAP-/-：173±3mmHg；P=NS)。骨髓來源的細(xì)胞特異性RAP基因敲除并不降低小鼠主動(dòng)脈弓動(dòng)脈粥樣硬化面積百分比(RAP+1+：24.07±2.14％；RAP-/-：19.24±2.21mg/dl；P=0.124)。但是骨髓來源的細(xì)胞特異性RAP基因敲除卻導(dǎo)致了腹主動(dòng)脈直徑的顯著升高(RAP+/+：0.99±0.04mm；RAP-/-：1.28±0.

11、12mm，P=0.01)，并增加AAAs的發(fā)生率(RAP+/+：4％；RAP-/-：41％，P=0.001)。 最后，我們通過體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)RAP，作為LRP1的伴侶蛋白，對(duì)LRP1表達(dá)的調(diào)控作用。Westernblotting顯示，RAP基因敲除完全阻斷成熟的LRP1蛋白在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。RAP基因敲除對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中LPR1的表達(dá)沒有影響。免疫染色顯示，RAP基因缺失降低了LRP1在肝臟細(xì)胞中的表達(dá)。 通過上述實(shí)

12、驗(yàn)，我們認(rèn)為： 1.RAP細(xì)胞依賴性的調(diào)節(jié)LRP1的表達(dá)； 2.Resident細(xì)胞中的RAP，通過獨(dú)立于LRP1的方式，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生； 3.骨髓來源細(xì)胞中的RAP保護(hù)AngⅡ誘導(dǎo)的AAAs發(fā)生，但該作用需進(jìn)一步研究證明。 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有如下的意義： 1.RAP調(diào)控LRP1的表達(dá)是細(xì)胞依賴性的，從而加深和豐富了人們對(duì)分子伴侶調(diào)控目標(biāo)蛋白表達(dá)的認(rèn)識(shí)。 2.通過嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首