UCP2參與血管緊張素Ⅱ誘導ApoE敲除小鼠腹主動脈瘤形成機制.pdf

1、目的：目前研究提示腹主動脈瘤（AAA）形成機制包括炎癥反應、基質(zhì)降解和重塑都與活性氧（ROS）有一定程度的關系，線粒體解偶聯(lián)蛋白2（UCP-2）被認為是抗氧化劑，位于線粒體內(nèi)膜的陰離子載體，在多個組織都有表達，通過維持活性氧的平衡防止氧化損傷；UCP-2在不同的細胞已經(jīng)被確定為凋亡抑制基因,主動脈瘤及夾層已被證實存在血管平滑肌細胞凋亡；因此，我們認為UCP-2是一個關鍵因素,通過抗氧化和抗凋亡抑制AAA的形成。為了確定這一假設，通過UC

2、P-2和載脂蛋白E（ApoE）雙基因敲除小鼠測定UCP-2在AAA的病理作用。
　　方法：
　　1、UCP-2-/-ApoE-/-雙敲小鼠由UCP-2-/-與ApoE-/-小鼠雜交產(chǎn)生，PCR法檢測基因敲除小鼠的基因分型，DNA樣本取自小鼠尾部；
　　2、實驗分組:野生小鼠(WT)、單基因敲除小鼠（ApoE-/-）、雙基因敲除小鼠(UCP-2-/-ApoE-/-)；
　　3、腹主動脈瘤造模：選擇8周齡雄性小鼠吸入

3、異氟醚麻醉后，將含有血管緊張素Ⅱ（1000ng／kg／min；Sigma）的微型滲透泵（Alzet，2004）置于小鼠背部皮膚下持續(xù)4周；
　　4、采用qRT PCR和蛋白免疫印跡試驗的方法檢測WT、ApoE-/-、ApoE-/-+Ang-Ⅱ各組腹主動脈UCP2 mRNA和蛋白的表達情況；
　　5、通過HE、VVG、-SMA染色的方法檢測小鼠造模4周后腹主動脈外膜增厚、彈性纖維、平滑肌細胞情況；
　　6、采用蛋白免疫印

4、跡試驗(Western blotting)檢測各組MMP2、MMP9炎癥因子在腹主動脈瘤的表達;
　　7、通過超氧化物陰離子熒光探針（DHE）染色評估活性氧（ROS）水平，用熒光顯微鏡490nm和590nm發(fā)射的激發(fā)波長觀察。活性氧ROS的熒光強度用ImageJ圖像處理軟件進行定量；通過NADPH氧化酶活性、丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性測定氧化應激水平，組織勻漿用二亞苯基碘(DPI)檢測NADPH氧化酶活性，

5、硫代巴比妥酸（TBA）檢測丙二醛，硝基四氮唑藍（NBT）檢測SOD活性；
　　8、TUNEL法檢測腹主動脈瘤細胞凋亡情況，在細胞凋亡過程中，會激活一些DNA酶使基因組DNA斷裂，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化下結(jié)合綠色熒光探針的熒光素（FITC）標記的dUTP，通過熒光顯微鏡檢測到；
　　半胱天冬酶-3（caspase3）是參與執(zhí)行細胞凋亡的一個關鍵酶，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞核底物，

6、最終導致細胞凋亡。通過caspase3蛋白免疫印跡檢測表達；
　　結(jié)果：
　　1、實驗結(jié)果提示UCP-2 mRNA及蛋白的表達在Ang-Ⅱ誘導的ApoE-/-造模小鼠均明顯增高，表明腹主動脈瘤UCP-2的表達變化發(fā)生在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平；
　　2、通過血管緊張素Ⅱ處理后，UCP-2-/-ApoE-/-雙敲小鼠腹主動脈瘤的發(fā)生率（83.9％，26 of31)明顯高于UCP-2+/+ApoE-/-小鼠(55%,11 of20)

7、，并且UCP-2-/-ApoE-/-小鼠主動脈明顯擴張，組織學研究顯示腹主動脈外膜肥厚，彈性纖維斷裂和平滑肌細胞減少；
　　3、通過熒光染料DHE染色檢測，UCP-2-/-ApoE-/-雙敲小鼠主動脈活性氧增加，UCP-2-/-ApoE-/-雙敲小鼠NADPH氧化酶活性和MDA水平明顯高于UCP-2+/+ApoE-/-或野生型小鼠，此外，UCP-2+/+ApoE-/-小鼠與野生型小鼠相比SOD活性增加，而UCP-2-/-ApoE-

8、/-雙敲小鼠SOD活性增加減少，表明UCP-2對血管緊張素-Ⅱ誘導的氧化應激和腹主動脈瘤形成起保護作用。研究結(jié)果還表明UCP-2基因敲除上調(diào)主動脈瘤MMP2和MMP9的表達；
　　4、TUNEL法檢測細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UCP-2-/-ApoE-/-小鼠中Ang-Ⅱ誘導VSMCs凋亡增加，并且在UCP-2-/-ApoE-/-小鼠血管組織caspase-3蛋白表達明顯增加；
　　結(jié)論：研究表明，在血管緊張素Ⅱ誘導的腹主動脈瘤造