重組腺病毒介導(dǎo)的hTERT C197片段抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題前期在hTERTC端截取編碼第936-1132氨基酸的堿基序列片段，構(gòu)建了真核和原核表達(dá)載體。該基因序列包括一個核仁定位信號序列（第965-981氨基酸）和與五個端粒DNA結(jié)合的氨基酸序列（第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸）。由于表達(dá)的hTERTC末端包含197個氨基酸，我們把它命名為C197。前期的研究表明，C197能夠抑制Hela細(xì)胞增殖。但

2、表達(dá)量不高，不便于后續(xù)研究。為了便于體內(nèi)試驗(yàn)和增強(qiáng)表達(dá)效果，本研究利用過表達(dá)載體重組腺病毒PAdEasy-1載體系統(tǒng)，構(gòu)建了能高效表達(dá)C197片段的重組腺病毒Ad-GFP-C197，通過觀察C197過表達(dá)在體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為進(jìn)一步研究hTERT的C末端功能打下基礎(chǔ)，同時也為腫瘤的生物治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.重組腺病毒Ad-GFP-C197構(gòu)建與表達(dá)
　　1.1 C

3、197基因片段的獲取
　　根據(jù)GenBank公布的人hTERT基因序列，選取C端第936-1132氨基序列片段（命名為C197），在該片段中的C端引入EcorⅤ限制性酶切位點(diǎn)，在N端引入6個his標(biāo)簽和SalⅠ限制性酶切位點(diǎn)，片段總長度為650 bp，將其合成后克隆至pGSI載體保存。使用時經(jīng)雙酶切后經(jīng)過回收純化得到外源基因片段C197即可。
　　1.2 重組腺病毒Ad-GFP-C197的構(gòu)建
　　將帶有6個his標(biāo)簽

4、C197的cDNA序列克隆至穿梭質(zhì)粒PAdTrack-CMV得到重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV-C197，經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入到含有骨架質(zhì)粒PAdEasy-1的BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，得到重組大質(zhì)粒PAd-GFP-C197并進(jìn)行一系列鑒定，確定構(gòu)建成功后，將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝，得到重組腺病毒Ad-GFP-C197。對照腺病毒Ad-GFP按照同樣的方法進(jìn)行構(gòu)建。
　　1.3 目的蛋白C197的表

5、達(dá)
　　把重組腺病毒Ad-GFP-C197感染新的一批HEK293細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA和細(xì)胞總蛋白后，用熒光定量PCR方法檢測C197 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，用免疫印跡法檢測鑒定目的蛋白C197表達(dá)情況。
　　1.4 重組腺病毒滴度測定
　　HEK293細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔5×105細(xì)胞。重組腺病毒用PBS稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76個梯度。待細(xì)胞貼壁后，將稀釋好的病毒每孔加入5

6、0 ul，每組實(shí)驗(yàn)共3個復(fù)孔。48 h觀察并計(jì)算綠色熒光數(shù)。熒光數(shù)在20-50個最佳。按照公式:病毒滴度PFU/ml=[(一個視野的熒光數(shù))*每個孔的視野數(shù)]/（加入的病毒體積*稀釋倍數(shù)）計(jì)算病毒滴度即可。
　　1.5 C197蛋白的表達(dá)與純化
　　按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對Hela細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按照1×106鋪板于100 mm2培養(yǎng)皿中（共15個皿），待細(xì)胞密度為80％時，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)（用重組腺病毒

7、Ad-GFP-C197用冷的無菌PBS稀釋后，以MOI=100感染各培養(yǎng)皿中Hela細(xì)胞）;待24 h后換液并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，于48 h收集細(xì)胞并提取總蛋白，利用金屬(Ni2+)柱（鎳柱）將帶有his標(biāo)簽的C197蛋白掛住，用梯度咪唑溶液進(jìn)行洗脫，回收洗脫液行SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察25 KDa附近是否有條帶即可。
　　1.6 重組腺病毒Ad-GFP-C197對Hela細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響
　

8、　按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。
　　將Hela細(xì)胞按1×104個接種到96孔培養(yǎng)板中，Hela細(xì)胞接7塊96孔板，共2個實(shí)驗(yàn)組(n=6)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后每隔24h取出一塊96孔培養(yǎng)板，MTT法測量所有實(shí)驗(yàn)孔OD值，對照病毒組和重組腺病毒組各有6個單獨(dú)樣本并對其OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　將Hela細(xì)胞按1×105個接種到24孔培養(yǎng)板中。接3塊24孔板，共2個實(shí)驗(yàn)組（Ad-GFP

9、-C197組和Ad-GFP組，n=3），待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后分別于24 h、48 h和72 h取出24孔培養(yǎng)板，按照AnnexinⅤ-PE凋亡試劑盒說明書處理樣品后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并收集數(shù)據(jù)，根據(jù)早期凋亡細(xì)胞占活細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算凋亡率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì);
　　以上均數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用單因素方差分析的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析其是否具有顯著性差異。
　　2.重組腺病毒Ad-GFP-C197的

10、細(xì)胞內(nèi)定位及對Hela細(xì)胞中端粒酶活性的影響
　　按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按1×105個接種到10 mm2共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù);分別于24 h和48 h用4％多聚甲醛固定后通過TRITC-二抗免疫熒光染色，細(xì)胞核用DAPI染色后，在免疫共聚焦顯微鏡下觀察C197蛋白位移情況。
　　同時將Hela細(xì)胞按2×105個接種6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。收集A

11、d-GFP-C197感染24 h、48h和72 h后的Hela細(xì)胞，對照病毒Ad-GFP感染72 h的Hela細(xì)胞以及正常的Hela細(xì)胞。分別提取總蛋白并調(diào)成一致濃度，按照TRAPEZE(R) Telomerase Detection Kit說明書操作;產(chǎn)物行12.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳后用EB溶液染色30min，純水泡30min后于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。
　　3.hTERT蛋白和NF-κB通路相關(guān)因子表達(dá)的檢測
　　按常規(guī)細(xì)

12、胞培養(yǎng)方法對Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按2×105個/孔接種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。提取各組細(xì)胞蛋白后，用免疫印跡法檢測hTERT蛋白、P65蛋白和IκBα蛋白表達(dá)情況。
　　4.重組腺病毒Ad-GFP-C197體內(nèi)對腫瘤的作用
　　按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。取周齡為4-6周的雄性裸鼠在12h日夜交替光照的條件下培養(yǎng)，收集好Hela細(xì)胞后與Matrigel調(diào)

13、整細(xì)胞密度為5×107個/mL，每只裸鼠的右下肢皮下接種0.2 ml Hela細(xì)胞。待腫瘤直徑達(dá)到4-6 mm時，隨機(jī)分為兩組并進(jìn)行瘤內(nèi)給藥Ad-GFP-C197和Ad-GFP。一周兩次，每隔1周測量一次體積，共給藥5周。根據(jù)每周體積繪制各組腫瘤生長曲線并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　最后一周將各組腫瘤組織取出并拍照，對其稱重后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;4％多聚甲醛固定后用Tunel法檢測各組腫瘤組織的凋亡情況;并用免疫組化法檢測各組腫瘤組織中P6

14、5、IκBα蛋白表達(dá)情況。另取一部分組織提取總蛋白行免疫印跡測定C197表達(dá)情況。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad-GFP-C197，且C197能夠在細(xì)胞中得到高效表達(dá)。
　　2.依照單因素方差分析結(jié)果顯示，重組腺病毒Ad-GFP-C197對Hela細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，并明顯抑制細(xì)胞增殖，在感染后第六天增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率最大（分別為49.49％和38.07％）。
　　3.在重組腺病毒Ad-GF

15、P-C197感染后的Hela細(xì)胞中觀察到C197蛋白能夠從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核，也驗(yàn)證了hTERT C端含有核仁定位信號。
　　4.C197蛋白純化結(jié)果顯示出三條蛋白條帶，且在分子量大小為25 KDa附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了C197蛋白表達(dá)后的確表達(dá)了且大小約為25KDa，同時為C197蛋白純化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　5.重組腺病毒Ad-GFP-C197能夠抑制Hela細(xì)胞中端粒酶活性，并且能夠下調(diào)hTERT蛋白的