MSCs載BMP7基因表達對缺氧再給氧腎小管上皮細胞保護作用的研究.pdf

1、背景: 缺血再灌注損傷(ischemicalreperfusioninjury,IRI)導(dǎo)致的缺血性急性腎功能衰竭(ischemicacuterenalfailure，IARF)是腎移植中影響移植腎早期功能恢復(fù)的主要因素之一。腎移植和某些疾病的發(fā)展及治療會不同程度的影響腎臟血流，當(dāng)血流再灌注后經(jīng)多因素介導(dǎo)，通過多種途徑造成腎小管、腎小球等組織結(jié)構(gòu)損傷，損害腎功能，因此，作為逆轉(zhuǎn)或修復(fù)損傷的治療手段，干細胞移植和基因治療已應(yīng)用于缺

2、血再灌注損傷防治的基礎(chǔ)及臨床研究中。干細胞治療是代表組織再生和修復(fù)革新性的治療技術(shù)。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMD-MSCs)遺傳背景穩(wěn)定，免疫原性低，移植體內(nèi)可調(diào)節(jié)免疫功能，適合同種異體移植，憑借以下優(yōu)勢為多種腎臟疾病的治療帶來了新的希望：一、較強的可塑性，具有高度自我更新和多向分化潛能，能跨系統(tǒng)或胚層分化為多種細胞，是一種可以廣泛應(yīng)用的組織工程細胞；二、靶向

3、遷移特性，可感受局部微環(huán)境信號變化，遷移、定居于腫瘤、炎癥、損傷等區(qū)域，是一種理想的載體細胞；三、取材方便，易于體外分離、純化、擴增，并能保持細胞表型和多系分化潛能不變，在體內(nèi)、外適宜的信號刺激與誘導(dǎo)下可分化為研究所需的細胞。缺血再灌注致急性腎功能衰竭，損傷較重，大量腎小管上皮細胞凋亡或壞死，腎小管結(jié)構(gòu)消失，組織纖維化，而可以逆轉(zhuǎn)這一過程的骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bonemorphogeneticprotein7，BMP7)具有治療效果。BM

4、P7是維持胚胎期腎臟正常發(fā)育的重要因子，可通過抑制上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)，促進間質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)化(mesenchymal-to-epithelialtransition，MET)等機制，對腎臟損傷有保護作用。在多種腎臟疾病模型中BMP7表達減少或缺如，經(jīng)靜脈給予BMP7可起治療作用。 目的: 作為hBMP7基因修飾.MSCs移植防治腎臟

5、缺血再灌注損傷課題的前期研究，模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，建立人腎近曲小管上皮細胞缺氧再給氧模型，觀測給予重組腺病毒介導(dǎo)hBMP7基因轉(zhuǎn)染后的MSCs培養(yǎng)液對細胞缺氧再給氧損傷是否有保護作用。 方法: 第一部分：取兔骨髓，經(jīng)密度梯度離心聯(lián)合貼壁法分離、培養(yǎng)原代MSCs，經(jīng)倒置相差顯微鏡、透射電鏡觀察，繪制生長曲線，流式細胞儀測定細胞周期，觀測所獲細胞的生物學(xué)特性。通過體外誘導(dǎo)分化對所獲細胞是否具有多向分化潛能進行鑒定。

6、 第二部分：將構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pDC316-hBMP7，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)與骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過同源重組獲得重組腺病毒載體Ad-hBMP7。對Ad-hBMP7進行鑒定。測定病毒滴度、最適感染復(fù)數(shù)和相應(yīng)轉(zhuǎn)染率后，通過RT-PCR檢測hBMP7mRNA水平表達，通過Westernblotting、免疫細胞化學(xué)染色、ELISA檢測hBMP7蛋白在細胞內(nèi)和培養(yǎng)液中的表達。 第三部分：將體外培養(yǎng)的人

7、腎近曲小管上皮細胞分為四組：A組，正常培養(yǎng)組；B組：缺氧再給氧組；C組：缺氧，再給氧+轉(zhuǎn)染hBMP7基因的MSCs培養(yǎng)液處理組；D組：缺氧，再給氧+未轉(zhuǎn)染hBMP7基因的MSCs培養(yǎng)液處理組。MTT比色法、流式細胞儀測定細胞損傷及修復(fù)情況。黃嘌呤氧化酶法測定總SOD活力，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，反映各組細胞抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化程度的變化。通過免疫細胞化學(xué)染色檢測各組細胞Bcl-2的表達變化。 結(jié)果: 1.倒置相差

8、顯微鏡觀察所獲細胞為梭形成纖維細胞樣細胞，長滿瓶底時呈漩渦狀、輻射狀排列。原代培養(yǎng)需要10～12d，傳代培養(yǎng)需要7～8d。培養(yǎng)至3代以上細胞形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，適合體內(nèi)移植和體外使用。透射電鏡觀察第3代細胞合成代謝旺盛。生長曲線顯示傳代細胞具有相似的生長特點。流式細胞儀分析細胞周期顯示大多數(shù)細胞處于靜止期與DNA合成前期，只有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期。第3代細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液體外培養(yǎng)不同時間后，通過鑒定已向成脂肪細胞或成骨細胞分化。

9、 2.重組腺病毒載體Ad-hBMP7構(gòu)建后，經(jīng)鑒定該載體攜帶hBMP7基因，感染細胞后表達hBMP7，并可向培養(yǎng)液中分泌該蛋白。經(jīng)擴增和純化，測定感染性滴度為7.94×1010IU/ml。最適感染復(fù)數(shù)為100，轉(zhuǎn)染率可達90％以上。轉(zhuǎn)染兔MSCs后24h，即可檢測到hBMP7mRNA表達，細胞內(nèi)和培養(yǎng)液中hBMP7表達陽性。 3.缺氧再給氧不同時間，MTT比色法檢測顯示B、C、D組活細胞減少；與B組相比，C、D組活細胞增多

10、，細胞相對死亡率降低，而C組比D組活細胞更多，細胞相對死亡率更低。缺氧再給氧4h，F(xiàn)CM檢測C、D組比B組凋亡或壞死細胞百分率降低，而C組比D組更低。C、D組總SOD活力較B組升高，而C組比D組更高；C、D組MDA含量較B組降低，而C組比D組更低。缺氧再給氧后，細胞Bcl-2蛋白表達陽性，Bcl-2蛋白表達量C、D組較B組高，而C組比D組更高。 結(jié)論: 1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁法可在體外大量擴增，純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞。

11、所獲細胞具有高度自我更新和多向分化潛能等干細胞生物學(xué)特性。 2.成功構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-hBMP7，病毒滴度較高，可高效轉(zhuǎn)染兔MSCs。轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)表達的hBMP7可向培養(yǎng)液中分泌。 3.MSCs培養(yǎng)液對缺氧再給氧損傷的人腎近曲小管上皮細胞有保護作用，可能與MSCs分泌某些保護性物質(zhì)有關(guān)；而載hBMP7基因的MSCs培養(yǎng)液對缺氧再給氧損傷的人腎近曲小管上皮細胞的保護作用更為明顯，除MSCs分泌某些保護性物質(zhì)外，hBM