質子感知受體OGR1介導胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞凋亡及機制.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 質子感知受體OGR1在椎間盤終板軟骨細胞的表達及調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞的作用
　　目的:研究大鼠椎間盤終板軟骨細胞是否表達OGR1受體及其調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞的凋亡和代謝作用。
　　方法:無菌分離約4周(160-200 g)大鼠腰椎終板軟骨組織，采用胰蛋白酶消化30 min后，用Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)大鼠腰椎終板軟骨細胞以及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，采取甲苯胺藍及

2、免疫組織化學染色（Ⅱ型膠原）對大鼠椎間盤終板軟骨細胞表型進行鑒定。利用PT-PCR檢測OGR1、G2A、GPR4及TDAG8四種質子感知受體mRNA在大鼠椎體終板軟骨細胞的表達，細胞外酸化(pH6.4)終板軟骨細胞1h后，用real-time PCR從mRNA水平分析OGR1亞家族表達情況;用Western blotting從蛋白水平分析終板軟骨細胞的OGR1表達情況;免疫熒光雙標法檢測OGR1在大鼠終板軟骨細胞的定位情況。構建攜帶OG

3、R1小發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒載體，敲除終板軟骨細胞OGR1。CellularDNA fragmentation enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)測定不同pH濃度對終板軟骨細胞凋亡率的影響。酸誘導軟骨細胞1h后通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染分析終板軟骨細胞凋亡情況，通過透射電鏡觀察終板軟骨細胞凋亡的形態(tài)學改變。用對二甲基亞甲藍分光法檢測大鼠椎體終板軟骨細胞培養(yǎng)上清液中糖胺

4、聚糖(GAG)的含量，氯胺T法檢測培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸(HYP)的含量，ELISA法和real-time PCR檢測MMP-2、MMP-9、TIMPs-1和TIMPs-2的含量。用細胞免疫化學方法檢測Ⅱ型膠原(COⅡ)的變化，用Western blotting方法分析終板軟骨細胞蛋白多糖聚糖體(aggrecan)的表達變化。
　　結果:剛切開的大鼠終板軟骨可見透亮軟骨，酶消化分離的終板軟骨細胞狀態(tài)近似圓球狀，細胞外基質(extra

5、cellular matrix，ECM)均勻、有層次感。大鼠終板軟骨細胞分離、原代與傳代培養(yǎng)中，我們在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)原代細胞大約24 h后大部分細胞貼壁，48 h后軟骨細胞開始增殖加快，大約5-7 d后軟骨細胞可傳下一代。甲苯胺藍染色結果可見大鼠終板軟骨細胞質有藍色異染出現(xiàn);免疫組化染色顯示培養(yǎng)的大鼠終板軟骨細胞和細胞外基質中有Ⅱ型膠原表達。PT-PCR結果發(fā)現(xiàn)OGR1mRNA在大鼠椎間盤終板軟骨細胞有高水平表達，G2A和TDA

6、G8 mRNA呈現(xiàn)低水平表達，GPR4 mRNA未見表達。real-time PCR顯示OGR1 mRNA在酸(pH6.4)誘導的大鼠椎間盤終板軟骨細胞的表達顯著增多，其它質子感知受體mRNA未見改變。Western blotting結果顯示OGR1蛋白表達于大鼠終板軟骨細胞，免疫熒光還顯示OGR1蛋白表達于大鼠終板軟骨細胞的細胞漿和胞膜。Western blotting結果顯示慢病毒載體能有效沉默OGR1蛋白的表達，證實我們有效構建了

7、OGR1-shRNA。DNA fragmentation ELISA結果顯示在細胞外進行1h的酸誘導，細胞凋亡呈時間依賴性，18h終板軟骨細胞凋亡最明顯。AnnexinⅤ-FITC流式細胞和透射電鏡進一步驗證以上發(fā)現(xiàn)。通過OGR1-shRNA阻斷OGR1能顯著抑制酸誘導的終板軟骨細胞凋亡（與對照組比較P＜0.05）。細胞胞外pH6.4酸誘導大鼠終板軟骨細胞對GAG和HYP的分泌，抑制MMP-2、MMP-9、TIMPs-1及TIMPs-2

8、的表達，而MMPs/TIMPs比率增強。敲除OGR1可有效阻斷胞外酸化pH6.4誘導GAG和HYP的分泌，抑制酸化pH6.4誘導MMP-2、MMP-9、TIMPs-1和TIMPs-2的表達降低，抑制MMPs/TIMPs比率的增強，也有效抑制pH6.4誘導的細胞外基質(ECM)的降解。
　　結論:大鼠椎間盤的終板軟骨細胞內(nèi)有OGR1的高表達。椎間盤終板軟骨細胞表達OGR1，受到細胞外酸化的調(diào)節(jié)。酸激活的OGR1在椎間盤終板軟骨細胞凋

9、亡和細胞代謝過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)性的功能。
　　第二部分 質子感知受體OGR1介導胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞凋亡的作用機制
　　目的:探討質子感知受體OGR1介導胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞凋亡的分子機制。
　　方法:大鼠腰椎終板軟骨細胞以及傳代培養(yǎng)。構建攜帶OGR1 shRNA的慢病毒載體，敲除終板軟骨細胞OGR1。應用Ca2+熒光探針Fluo-3/AM孵育培養(yǎng)的大鼠終板軟骨細胞，采用激光共聚焦顯微鏡

10、方法研究酸誘導的Ca2+熒光強度及細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)動態(tài)變化，并檢測特異性阻斷OGR1、細胞外鈣離子螯合劑(EGTA，50μM)、細胞內(nèi)選擇性鈣離子螯合劑(BAPTA/AM，0.5 mM)和磷脂酶C(PLC)阻斷劑U73122（10μM）以確定其對酸誘導胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響。用Cellular DNA fragmentation enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)測定鈣離

11、子信號通路中特異性阻斷劑(BAPTA-AM，50μM; EGTA，0.5 mM; U73122，10μM;鈣蛋白酶(calpain)抑制劑（calpeptin，10μM）;鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin）抑制劑(cyclosporine A，1μM);鈣調(diào)激酶Ⅱ抑制劑(KN-93，1μM)對酸誘導的終板軟骨細胞凋亡率的影響。用Western blotting從蛋白水平分析鈣敏感的蛋白酶calpain和calcineurin的表達以及

12、下游相關凋亡蛋白如Bid、Bad、Caspase3、poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)、caspase3激活和PARP劈裂片段在酸pH6.4處理的OGR1-shRNA、NC-shRNA以及BAPTA-AM組不同時間點的表達。
　　結果:激光共聚焦Ca2+熒光實驗顯示pH6.4的酸化明顯誘導大鼠終板軟骨細胞凋亡和[Ca2+]i的升高;shRNA阻斷OGR1能夠有效抑制酸誘導的終板軟骨細胞凋亡和[Ca2

13、+]i的增加。我們發(fā)現(xiàn)利用細胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM，0.5 mM)螯合細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)后，可以顯著抑制酸(pH6.4)誘導的細胞內(nèi)[Ca2+]i升高，而細胞外的鈣離子螯合劑的EGTA（50μM）螯合了細胞外鈣離子后，對抑制酸(pH6.4)誘導的細胞內(nèi)[Ca2+]i升高不明顯。[Ca2+]i升高主要是通過磷酸脂酶C(PLC)途徑的激活，導致細胞胞內(nèi)鈣庫內(nèi)Ca2+的釋放，從而提高細胞內(nèi)游離的[Ca2+]i。研究發(fā)現(xiàn)PLC

14、抑制劑U73122能顯著抑制酸(pH6.4)誘導的細胞內(nèi)[Ca2+]i升高，說明酸誘導的鈣離子濃度升高是通過PLC途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn)10μM calpeptin或1μM cyclosporine A能夠顯著抑制酸(pH6.4)誘導的終板軟骨細胞凋亡率，而鈣調(diào)節(jié)酶Ⅱ抑制劑KN-93對酸(pH6.4)誘導的終板軟骨細胞凋亡未見顯著抑制作用，以上結果說明酸誘導的終板軟骨細胞凋亡是依賴于鈣敏感的蛋白酶calpain和calcineurin途徑

15、，而非依賴于鈣調(diào)激酶Ⅱ途徑。Western blotting實驗結果顯示，與正常對照比較，calpain和calcineurin蛋白在酸(pH6.4)組的表達顯著增加，通過shRNA阻斷OGR1后，顯著抑制酸(pH6.4)誘導的蛋白酶calpain和calcineurin的蛋白表達，而對照NC-shRNA組calpain和calcineurin的蛋白表達未見明顯改變，說明OGR1介導胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)控椎間盤終板軟骨細胞凋亡是通過Ca2

16、+敏感的蛋白酶calpain和calcineurin信號途徑。下游相關凋亡蛋白Bid在酸誘導4h后，與0h比較表達顯著增加;與0h比較酸誘導8hBad蛋白的表達顯著增加;caspase3激活和PARP劈裂片段在酸誘導4h后，蛋白表達顯著增加。細胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM，0.5 mM)螯合細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)后，Bid、Bad、Caspase3、PARP、Caspase3激活和PARP劈裂片段在酸(pH6.4)處理后，蛋白的