肺Clara細(xì)胞及其分泌蛋白CC10有效片段AF-1對內(nèi)毒素急性肺損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌脂多糖(LPS)是引起急性肺損傷的重要因素，LPS與體內(nèi)相應(yīng)受體結(jié)合后，在肺內(nèi)啟動多種信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，導(dǎo)致各類炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而引起急性肺損傷。目前支氣管上皮細(xì)胞與肺炎和肺損傷發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系日益受到重視，其在炎癥的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體的免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用也逐漸有了新的認(rèn)識。Clara細(xì)胞是襯覆于遠(yuǎn)端細(xì)支氣管的主要上皮細(xì)胞，為非纖毛上皮細(xì)胞。研究表明，Clara細(xì)胞具有多種功能。已發(fā)現(xiàn)，Clara細(xì)胞分泌的一種10Kd蛋白(CC

2、10)在體外實驗中具有強(qiáng)的抗炎特性。且CC10基因敲除小鼠，在炎性刺激下表現(xiàn)為過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。但在整體情況下，Clara細(xì)胞以及CC10如何影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程，以及Clara細(xì)胞在機(jī)體的天然免疫及獲得性免疫中所發(fā)揮的作用，一直沒有很好的闡明。 肺巨噬細(xì)胞(AM)是健康肺主要的噬菌細(xì)胞，在肺的天然防御及獲得性免疫中，占有重要的地位。近年的研究表明，在炎癥的發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞的功能發(fā)生了獨(dú)特的變化，AM的功能的變化與肺部的其他

3、細(xì)胞及分泌成分，有著復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)，這種聯(lián)系的時空變化在一定程度上左右著肺炎的發(fā)生發(fā)展及最后的轉(zhuǎn)歸。但目前對AM功能的調(diào)控與肺支氣管Clara細(xì)胞分泌蛋白CC10的關(guān)系卻少有研究。 Antiflammin-1(AF-1)是根據(jù)CC10序列人工設(shè)計合成的衍生多肽，其序列為MQMKKVLDS，與CC10蛋白羧基端39-47氨基酸殘基序列一致，并具有CClO的有效活性。但已有的研究普遍證明AF-1具有明顯的抗炎作用。由于AF-1是CC

4、10的有效片段，通過觀察AF-1的作用，將為探討CC10在體內(nèi)的作用提供新的啟迪，同時也可能為肺炎肺損傷的防治新的治療方法。 本課題研究目的是： ①建立Clara細(xì)胞去除模型，在LPS刺激下，利用高通量技術(shù)觀察肺組織炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的變化，初步從整體角度，探討Clara細(xì)胞在肺部炎癥和肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用； ②將人工合成CC10有效片段Antiflammin-1(AF-1)應(yīng)用于LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷及Cl

5、ara細(xì)胞損傷小鼠LPS急性肺損傷的防治，探討Clara細(xì)胞的炎癥反應(yīng)調(diào)控作用中的地位，以及AF-1用于肺損傷防治的可能性； ③利用AF-1干預(yù)，觀察巨噬細(xì)胞在LPS刺激下細(xì)胞因子表達(dá)變化和巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR-4的作用。以探討CC10在體內(nèi)的可能生理意義及作用機(jī)制。 方法: ①利用萘揮發(fā)氣攻擊建立Clara細(xì)胞去除動物模型。免疫組化進(jìn)行確認(rèn)。 ②利用肺濕/干重比、灌洗液LDH活性，白細(xì)胞總數(shù)，總蛋白量，肺

6、組織髓過氧化物酶活性等指標(biāo)確定肺炎/肺損傷程度。 ③利用高通量的基因芯片技術(shù)和realtime PCR技術(shù)觀測肺組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)譜變化，利用luminex技術(shù)及ELISA測定主要炎癥相關(guān)因子蛋白水平。 ④利用流式細(xì)胞儀測定巨噬細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，確定AF-1對TLR-4受體表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1.通過氣道吸入100ppm萘揮發(fā)氣，攻擊2、4、8h，其中攻擊4h即可使小鼠終末細(xì)支氣管上的Clara細(xì)胞幾

7、乎完全破壞，并且，此時小鼠除支氣管肺泡灌洗液除蛋白水平升高外，其肺組織MPO活性、支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、LDH活性并沒有明顯變化。 2.去除Clara細(xì)胞后，多數(shù)趨化因子如MIP-1，MIP-2，IP和EotaxinmRNA表達(dá)下調(diào)，促炎細(xì)胞因子IL-1b、IL-6、IL-12基因表達(dá)下調(diào)。而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10基因表達(dá)上調(diào)。但在蛋白水平，除Clara細(xì)胞小鼠與正常小鼠相比IL-10蛋白含量明顯升高

8、外，肺組織多數(shù)趨化因子，細(xì)胞因子含量沒有明顯變化。 3.LPS攻擊Clara細(xì)胞去除小鼠，趨化因子KC、IP、MIG、MCS以及促炎因子IL-1b、IL-6 mRNA明顯升高，與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的Th1(IL-2、IFN-γ)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)細(xì)胞因子mRNA下調(diào)。從蛋白水平看，在LPS作用下，健康及Clara細(xì)胞去除小鼠兩者肺組織趨化因子KC、IP、MIG、MCP以及炎癥早期的細(xì)胞因子TNF

9、α、IL-1b、IL-6、IL-12含量都明顯增多，與基因表達(dá)表現(xiàn)一致。 4.相對于Clara細(xì)胞未去除小鼠，在LPS作用下，Clara細(xì)胞去除小鼠趨化因子IP-10、MIG的含量升高更明顯，但細(xì)胞因子IL-10下降較對照明顯。提示肺內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。 5.氣管內(nèi)給予Antiflammin-1，既可明顯降低LPS所致Clara細(xì)胞去除小鼠肺部的炎癥反應(yīng)和肺損傷程度，也可降低LPS誘導(dǎo)的Clara細(xì)胞未去除小鼠的炎癥反

10、應(yīng)，表現(xiàn)為AF-1預(yù)先處理后，兩類小鼠在受LPS作用時，肺的濕干重比，肺灌洗液細(xì)胞總數(shù)和總蛋白下降，肺組織病理學(xué)改變減輕。肺組織多數(shù)趨化因子KC、IP、MIG、MCS以及細(xì)胞因子TNFα、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-10表達(dá)及蛋白含量不升高或下降。 6.體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),AF-1對LPS刺激的肺泡巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1b、IL-6mRNA表達(dá)及蛋白合成有抑制作用。而對LPS刺激的巨噬細(xì)胞IL-10的表達(dá)表現(xiàn)

11、為促進(jìn)作用?？笽L-10抗體可減弱AF-1對促炎細(xì)胞因子的抑制效果。同時AF-1可下調(diào)LPS刺激的巨噬細(xì)胞表面TLR-4的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞對LPS的敏感性。 結(jié)論: 1.吸入100ppm濃度萘揮發(fā)氣，攻擊4h，可成功建立小鼠Clara細(xì)胞特異性破壞動物模型。 2.Clara細(xì)胞去除小鼠肺部表現(xiàn)為Th2類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)升高：促炎因子及多數(shù)趨化因子mRNA表達(dá)下調(diào)；但蛋白水平除IL-10升高外，其他細(xì)胞因子趨

12、化因子變化不明顯。提示單純?nèi)コ鼵lara細(xì)胞整體并不表現(xiàn)明顯的肺部炎癥。 3.Clara細(xì)胞去除小鼠在受LPS刺激后，肺組織趨化因子mRNA表達(dá)明顯升高，早期促炎因子IL-6，TNF-α mRNA上調(diào)，但Th1及Th2細(xì)胞因子mRNA都下調(diào)，提示Clara細(xì)胞在肺部炎性反應(yīng)中參與趨化活動以及細(xì)胞性免疫反應(yīng)與體液性免疫反應(yīng)的調(diào)控。 4.首次發(fā)現(xiàn)AF-1具有抑制LPS誘導(dǎo)的肺損傷作用，但不能改變LPS所致Clara細(xì)胞去除小