肺Clara細胞及其分泌蛋白CC10有效片段AF-1對內(nèi)毒素急性肺損傷的影響及機制研究.pdf

1、細菌脂多糖(LPS)是引起急性肺損傷的重要因素，LPS與體內(nèi)相應受體結合后，在肺內(nèi)啟動多種信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，導致各類炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進而引起急性肺損傷。目前支氣管上皮細胞與肺炎和肺損傷發(fā)生發(fā)展之間的關系日益受到重視，其在炎癥的發(fā)生發(fā)展以及機體的免疫反應中的調(diào)控作用也逐漸有了新的認識。Clara細胞是襯覆于遠端細支氣管的主要上皮細胞，為非纖毛上皮細胞。研究表明，Clara細胞具有多種功能。已發(fā)現(xiàn)，Clara細胞分泌的一種10Kd蛋白(CC

2、10)在體外實驗中具有強的抗炎特性。且CC10基因敲除小鼠，在炎性刺激下表現(xiàn)為過強的炎癥反應。但在整體情況下，Clara細胞以及CC10如何影響機體的炎癥反應過程，以及Clara細胞在機體的天然免疫及獲得性免疫中所發(fā)揮的作用，一直沒有很好的闡明。 肺巨噬細胞(AM)是健康肺主要的噬菌細胞，在肺的天然防御及獲得性免疫中，占有重要的地位。近年的研究表明，在炎癥的發(fā)展過程中，巨噬細胞的功能發(fā)生了獨特的變化，AM的功能的變化與肺部的其他

3、細胞及分泌成分，有著復雜的相互關聯(lián)，這種聯(lián)系的時空變化在一定程度上左右著肺炎的發(fā)生發(fā)展及最后的轉歸。但目前對AM功能的調(diào)控與肺支氣管Clara細胞分泌蛋白CC10的關系卻少有研究。 Antiflammin-1(AF-1)是根據(jù)CC10序列人工設計合成的衍生多肽，其序列為MQMKKVLDS，與CC10蛋白羧基端39-47氨基酸殘基序列一致，并具有CClO的有效活性。但已有的研究普遍證明AF-1具有明顯的抗炎作用。由于AF-1是CC

4、10的有效片段，通過觀察AF-1的作用，將為探討CC10在體內(nèi)的作用提供新的啟迪，同時也可能為肺炎肺損傷的防治新的治療方法。 本課題研究目的是： ①建立Clara細胞去除模型，在LPS刺激下，利用高通量技術觀察肺組織炎癥相關細胞因子表達的變化，初步從整體角度，探討Clara細胞在肺部炎癥和肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用； ②將人工合成CC10有效片段Antiflammin-1(AF-1)應用于LPS誘導的小鼠肺損傷及Cl

5、ara細胞損傷小鼠LPS急性肺損傷的防治，探討Clara細胞的炎癥反應調(diào)控作用中的地位，以及AF-1用于肺損傷防治的可能性； ③利用AF-1干預，觀察巨噬細胞在LPS刺激下細胞因子表達變化和巨噬細胞表達TLR-4的作用。以探討CC10在體內(nèi)的可能生理意義及作用機制。 方法: ①利用萘揮發(fā)氣攻擊建立Clara細胞去除動物模型。免疫組化進行確認。 ②利用肺濕/干重比、灌洗液LDH活性，白細胞總數(shù)，總蛋白量，肺

6、組織髓過氧化物酶活性等指標確定肺炎/肺損傷程度。 ③利用高通量的基因芯片技術和realtime PCR技術觀測肺組織炎癥相關基因表達譜變化，利用luminex技術及ELISA測定主要炎癥相關因子蛋白水平。 ④利用流式細胞儀測定巨噬細胞平均熒光強度，確定AF-1對TLR-4受體表達的影響。 結果: 1.通過氣道吸入100ppm萘揮發(fā)氣，攻擊2、4、8h，其中攻擊4h即可使小鼠終末細支氣管上的Clara細胞幾

7、乎完全破壞，并且，此時小鼠除支氣管肺泡灌洗液除蛋白水平升高外，其肺組織MPO活性、支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)、LDH活性并沒有明顯變化。 2.去除Clara細胞后，多數(shù)趨化因子如MIP-1，MIP-2，IP和EotaxinmRNA表達下調(diào)，促炎細胞因子IL-1b、IL-6、IL-12基因表達下調(diào)。而Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-10基因表達上調(diào)。但在蛋白水平，除Clara細胞小鼠與正常小鼠相比IL-10蛋白含量明顯升高

8、外，肺組織多數(shù)趨化因子，細胞因子含量沒有明顯變化。 3.LPS攻擊Clara細胞去除小鼠，趨化因子KC、IP、MIG、MCS以及促炎因子IL-1b、IL-6 mRNA明顯升高，與免疫反應密切相關的Th1(IL-2、IFN-γ)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)細胞因子mRNA下調(diào)。從蛋白水平看，在LPS作用下，健康及Clara細胞去除小鼠兩者肺組織趨化因子KC、IP、MIG、MCP以及炎癥早期的細胞因子TNF

9、α、IL-1b、IL-6、IL-12含量都明顯增多，與基因表達表現(xiàn)一致。 4.相對于Clara細胞未去除小鼠，在LPS作用下，Clara細胞去除小鼠趨化因子IP-10、MIG的含量升高更明顯，但細胞因子IL-10下降較對照明顯。提示肺內(nèi)產(chǎn)生更強的炎癥反應。 5.氣管內(nèi)給予Antiflammin-1，既可明顯降低LPS所致Clara細胞去除小鼠肺部的炎癥反應和肺損傷程度，也可降低LPS誘導的Clara細胞未去除小鼠的炎癥反

10、應，表現(xiàn)為AF-1預先處理后，兩類小鼠在受LPS作用時，肺的濕干重比，肺灌洗液細胞總數(shù)和總蛋白下降，肺組織病理學改變減輕。肺組織多數(shù)趨化因子KC、IP、MIG、MCS以及細胞因子TNFα、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-10表達及蛋白含量不升高或下降。 6.體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),AF-1對LPS刺激的肺泡巨噬細胞促炎因子IL-1b、IL-6mRNA表達及蛋白合成有抑制作用。而對LPS刺激的巨噬細胞IL-10的表達表現(xiàn)

11、為促進作用?？笽L-10抗體可減弱AF-1對促炎細胞因子的抑制效果。同時AF-1可下調(diào)LPS刺激的巨噬細胞表面TLR-4的表達，降低巨噬細胞對LPS的敏感性。 結論: 1.吸入100ppm濃度萘揮發(fā)氣，攻擊4h，可成功建立小鼠Clara細胞特異性破壞動物模型。 2.Clara細胞去除小鼠肺部表現(xiàn)為Th2類細胞因子mRNA表達升高：促炎因子及多數(shù)趨化因子mRNA表達下調(diào)；但蛋白水平除IL-10升高外，其他細胞因子趨

12、化因子變化不明顯。提示單純?nèi)コ鼵lara細胞整體并不表現(xiàn)明顯的肺部炎癥。 3.Clara細胞去除小鼠在受LPS刺激后，肺組織趨化因子mRNA表達明顯升高，早期促炎因子IL-6，TNF-α mRNA上調(diào)，但Th1及Th2細胞因子mRNA都下調(diào)，提示Clara細胞在肺部炎性反應中參與趨化活動以及細胞性免疫反應與體液性免疫反應的調(diào)控。 4.首次發(fā)現(xiàn)AF-1具有抑制LPS誘導的肺損傷作用，但不能改變LPS所致Clara細胞去除小