組成型表達雞致病性大腸桿菌fimA與ompC融合蛋白的重組乳酸桿菌的構(gòu)建及其在雞腸道定殖特性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、禽大腸桿菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大腸埃希氏菌(APEC)感染禽類引起的多種臨床病型的總稱。主要表現(xiàn)有胚胎和幼雛的死亡、敗血癥、氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、腸炎、腹膜炎和大腸桿菌性肉芽腫等。病原性大腸埃希氏菌(E.coli)血清型眾多,抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜,給防治本病帶來了困難,因此,尋求針對主要致病大腸桿菌免疫保護譜廣的抗原物質(zhì),并模擬其自然感染的黏膜免疫,對該病的特異性免疫防治具有重要的實踐意義。
 

2、 為得到引發(fā)黏膜免疫并傳遞特異性抗原物質(zhì)的活菌載體,本實驗從健康雞腸道分離乳酸桿菌進行鑒定,并對其對于腸道的粘附能力和耐藥性進行了檢測。通過形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性鑒定以及16s rRNA鑒定,共獲得了8株乳酸桿菌,其中包括3株Lactobacillus crispatus(卷曲乳桿菌)、2株Lactobacillus johnsonii(約氏乳桿菌)、2株Lactobacillus salivarius(唾液乳桿菌)和1株Lactobac

3、illus saerimneri。8株乳酸桿菌在37℃和42℃均能良好生長;抑菌試驗表明,對革蘭氏陽性及陰性細菌均有一定的抑菌活性。體外粘附實驗表明,8株乳酸桿菌均具有一定的粘附特性,可在腸道內(nèi)定殖??股孛舾行詫嶒灡砻?株乳酸桿菌對多種抗生素敏感。
  在特異性抗原物質(zhì)的制備上,選用APEC O1血清型的Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)作為靶抗原基因片段,以APEC基因組為模板,A1和A2為引物,經(jīng)PCR擴增5'端

4、帶有ApalⅠ酶切位點和linker序列,3'端帶有ApaⅠ酶切位點的528bp的基因片斷FimA。以C1、C2為引物,擴增5'端帶有SacⅠ酶切位點和Flag標簽序列,3'端帶有ApalⅠ酶切位點的1074bp的基因片段OmpC。再將FimA和OmpC與T載體進行亞克隆連接構(gòu)建,獲得二者基因融合的重組質(zhì)粒pMD18-T-OmpC-fimA,構(gòu)建了Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)的融合基因片段。
  利用限制性內(nèi)切酶

5、SacⅠ和ApaⅠ將融合基因片段酶切后定向插入含有HCE組成型強啟動子并具有錨定結(jié)構(gòu)序列(Anchor)的乳酸菌組成型表面表達載體pPG-T7g10-PPT中,并將重組質(zhì)粒pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA電轉(zhuǎn)化入工程菌干酪乳桿菌Lactobacillus casei393和雞腸道分離的乳酸桿菌M-11(Lactobacillus saerimneri)中,構(gòu)建獲得了兩株重組菌pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/

6、L393和pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/M-11。Western blot檢測結(jié)果表明融合基因在兩株乳酸桿菌中均獲得了表達,出現(xiàn)了約101KDa的特異性反應(yīng)帶。重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)定殖特性分析結(jié)果表明,飼喂重組菌可以使肉仔雞的日增重明顯增加,與對照組相比差異顯著;模擬腸道環(huán)境中,重組菌可耐受pH=3的酸性環(huán)境,在0.1%的膽汁酸鹽環(huán)境中可良好生長;重組菌可在雞腸道內(nèi)定殖,在免疫后的14天,重組菌的數(shù)量趨于穩(wěn)定,一直持

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