人纖溶酶原Kringle 5突變體K5mut2和K5mut4的構(gòu)建及抗血管增生活性的變化.pdf

1、血管增生(Angiogenesis)是惡性腫瘤、血管增生性眼病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等重大疾病的重要病理特征之一，運(yùn)用內(nèi)源性血管增生抑制劑抑制血管增生已經(jīng)成為治療血管增生性疾病的重要策略。人纖溶酶原(plasminogen)的水解片斷kringle5是目前發(fā)現(xiàn)的活性較強(qiáng)的血管增生抑制劑之一，因其有分子量較小，性質(zhì)穩(wěn)定成為抗血管增生的研究熱點(diǎn)。 人纖溶酶原是分子量92KD的糖蛋白，含有5個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(Kringle)，每個環(huán)由80個氨基酸

2、殘基組成，含有3個二硫鍵，形成雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)。人纖溶酶原水解后可以產(chǎn)生一組具有抑制血管增生的小片段分子：血管抑素(Agiostatin,即Kringle1-4)，Kringle1-5，Kringele1-3，和Kringle5。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)K5較血管抑素有更強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，而且可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期阻滯。 但相對于K5功能和潛在臨床應(yīng)用價值的研究，其抑制血管增生的活性和Kringl

3、e結(jié)構(gòu)域中二硫鍵的位置、數(shù)量所決定的內(nèi)外環(huán)結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不明確。目前對于K5的抗血管增生活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系國內(nèi)外的研究結(jié)果并不一致。有研究發(fā)現(xiàn)還原或烷基化的處理的K5比K5本身具有更強(qiáng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。但是有人用高濃度的尿素(8Mol/L)作為變性條件處理純化的K5，能使K5喪失抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的能力，這又表明K5某些天然就構(gòu)特征是維持其生物活性所必須的。天然構(gòu)型的K5還是還原型K5更有活性需要進(jìn)一步探索。因此本課題組K5結(jié)構(gòu)與功能

4、的關(guān)系進(jìn)行了研究，對K5分子進(jìn)行改造，獲得K5的2種缺失突變體K5mut1(Cys462-Cys541)和K5mut3(Cys483-Cys536)，其中K5mut1刪除了野生型K5N端的10個氨基酸和C端的1個氨基酸，保留了完整的Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)和3個二硫鍵(Cys462-Cys541Cys483-Cys524Cys512-Cys536)；K5mut3打開了Kringle環(huán)第一個二硫鍵，保留了部分的Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)和2個二硫鍵

5、(Cys483-Cys524Cys512-Cys536)。對K5、K5mut1、K5mut3抗血管增生活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明K5mut1對視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanretinalcapillaryendothelialcell,HRCEC)有明顯的抑制增殖作用，其EC50(抑制50％細(xì)胞增殖的藥物濃度)是K5的一半，提示K5分子中的Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)外的N端和C端氨基酸殘基并不是其活性所必需。K5蛋白N端氨基酸臂含有的豐富的酸性

6、氨基酸和某些支鏈氨基酸形成的空間結(jié)構(gòu)可能與Kringle環(huán)相互作用反而會使K5抗血管增生受到抑制。K5mut3蛋白完全喪失對內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用，提示Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)的完整性可能是維持K5抗血管活性的必需結(jié)構(gòu)域。但是由于K5mut3不僅打開了第一個二硫鍵破壞了Kringle環(huán)的完整性，同時比K5mut1缺少了N端21個氨基酸殘基和C端5個氨基酸殘基，這些氨基酸殘基可能是K5發(fā)揮活性的必需基團(tuán)，因此尚不能說明K5二硫鍵的數(shù)量和位置所決定

7、的Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)與K5的功能到底有著什么細(xì)微的關(guān)系。因此為了解決上述的問題，本課題將K5mut1和K5mut3進(jìn)一步改造，分別去除N端第一個氨基酸(為半胱氨酸，分別構(gòu)成K5的第一個和第二個二硫鍵)，構(gòu)建了突變體K5mut2(Met463-Cys541)和K5mut4(Gln484-Cys536)，研究突變后抗血管增生活性的變化，揭示K5的抗血管增生活性是否依賴于完整的Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)及K5二硫鍵的數(shù)量和位置所決定的Kringl