首次接種羊輪狀病毒疫苗的排毒研究.pdf

1、背景和目的：
　　 輪狀病毒(rotavirus，RV)自1973年發(fā)現(xiàn)后，就被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致兒童急性腹瀉的主要病原體，5歲以下的兒童幾乎全部感染過輪狀病毒。全球每年因輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉疾病占因腹瀉而住院兒童的39％(22～55％)，并造成約611，000(454，000～705，000)兒童的死亡，其中多數(shù)死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。中國是世界上第二大人口出生國，每年因為輪狀病毒感染導(dǎo)致的兒童死亡總數(shù)也排名世界第二。我國因重癥腹瀉住

2、院的兒童中有41％的大便標(biāo)本檢測為輪狀病毒陽性，每年發(fā)生輪狀病毒性腹瀉的兒童有1700萬人，并導(dǎo)致38405人的死亡，占世界輪狀病毒性腹瀉死亡的8％。
　　 目前還沒有針對輪狀病毒腹瀉的特效治療，因此研發(fā)輪狀病毒疫苗變得至關(guān)重要。羊輪狀病毒疫苗(LLR)由蘭州生物制品研究所研制，該疫苗于1985年從當(dāng)?shù)氐囊恢桓嵫蚍蛛x出來并由牛腎細(xì)胞經(jīng)過37代的減毒培養(yǎng)培養(yǎng)而來。LLR為單價減毒活疫苗，屬A組輪狀病毒，基因型為G10P[15]。該

3、疫苗于2000年獲批上市，主要用來預(yù)防因輪狀病毒感染而導(dǎo)致的重癥腹瀉。自上市以來，每年大約有50萬兒童接種該苗。在一項臨床三期實驗中，LLR產(chǎn)生的相關(guān)抗體產(chǎn)生率為60％，但是未對疫苗保護(hù)效果(vaccine，VE)進(jìn)行評價。一項1∶1配對病例對照研究中，研究者調(diào)查了2002～2004年中的838對兒童，表明該疫苗的疫苗保護(hù)效果為73.3％（95％可信區(qū)間:61.2～81.6％）。
　　 輪狀病毒疫苗接種方式為口服減毒或滅活的疫苗

4、，部分疫苗毒株會隨著排泄物排出體外，造成疫苗的排毒現(xiàn)象。幾乎所有的輪狀病毒疫苗，不論是減毒活疫苗，還是重組疫苗，均能產(chǎn)生輪狀病毒排毒。各種輪狀病毒疫苗都可引發(fā)排毒，但是排毒發(fā)生概率不等，差別很大，且排毒量和排毒持續(xù)時間也不一致。一般來說排毒發(fā)生在服苗后1～10天，排毒量在104～107pFU/ml，所以建議免疫力低下或免疫力缺失者避免同服用輪狀病毒疫苗14天內(nèi)的兒童接觸。在排毒的傳染性方面，傳統(tǒng)的四價恒河猴疫苗比目前常用的減毒單價疫苗和

5、重組疫苗要強(qiáng);兒童和老年人比成年人更易受到疫苗排毒的感染。國外關(guān)于輪狀病毒疫苗的排毒研究的報道比較多，由于羊輪狀病毒疫苗(LLR)沒進(jìn)行大規(guī)模的臨床實驗，現(xiàn)有的科研人員對該疫苗的關(guān)注也主要是放在疫苗的安全評價和保護(hù)率方面，有關(guān)羊輪狀病毒疫苗的排毒情況以及傳染性方面的評價未見報道。
　　 本研究擬跟蹤調(diào)查首次接種羊輪狀病毒疫苗的兒童14天，收集調(diào)查對象每天的大便標(biāo)本并進(jìn)行輪狀病毒檢測，以確定疫苗的排毒率、排毒量和排毒時間;同時跟蹤

6、調(diào)查兒童服苗后的不良反應(yīng)情況（如發(fā)熱、食欲減退、腹瀉、活動力減少、精神萎靡等）以及密切接觸的家庭成員是否發(fā)生因輪狀病毒疫苗排毒而導(dǎo)致的感染情況，旨在評價羊輪狀病毒疫苗的排毒情況以及傳染性。
　　 對象和方法
　　 1.研究對象研究對象來自2011年9月～2012年10月北京市豐臺區(qū)婦幼保健醫(yī)院保健科首次接種LLR的兒童。入選標(biāo)準(zhǔn)為首次接種輪狀病毒疫苗、年齡2～36月并由父母或監(jiān)護(hù)人簽字同意的健康兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)為免疫力低下

7、或免疫缺失者、服苗前一周有過其他疫苗接種史者、服苗前一周有發(fā)熱和（或）腹瀉癥狀者以及有過輪狀病毒腹瀉史者。本研究通過了中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防和控制研究所倫理委員會的同意。
　　 2.疫苗和疫苗接種LLR為單價減毒活疫苗，屬A組輪狀病毒，基因型為G10P[15]?？诜啝畈《净钜呙缦挡捎幂啝畈《緶p毒株感染新生小牛腎細(xì)胞，經(jīng)培育、收獲病毒液后加入時宜的甜味保護(hù)劑制成，為橙紅或粉紅色澄清液體。規(guī)格為每瓶1人份，每瓶劑量3.0m

8、l。每1ml疫苗所含活病毒量應(yīng)不低于5.51gPFU/ml或(l)gCCID50。每次人用口服劑量為3.0ml。該疫苗主要用于2月～3歲嬰幼兒，每年服用一次，接種時間為每年的7～9月。
　　 3.研究設(shè)計依據(jù)本研究的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，采取當(dāng)面詢問調(diào)查兒童家長的方式進(jìn)行篩選對象。將可納入本研究的兒童信息在豐臺區(qū)保健科的EPI系統(tǒng)上進(jìn)行核對，以確保家長反映的信息的正確性。一旦家長簽字同意參與本次調(diào)查研究，家長們將在調(diào)查員的指導(dǎo)下完成一

9、份問卷調(diào)查表的填寫。該問卷調(diào)查表包含接種疫苗兒童的基本信息、家庭情況、地址、聯(lián)系方式以及未來14天內(nèi)大便標(biāo)本收集情況和不良反應(yīng)發(fā)生情況。然后由調(diào)查者發(fā)給家長14個大便標(biāo)本塑料收集瓶、若干標(biāo)簽紙和一份使用說明書。調(diào)查人員在隨后14天內(nèi)聯(lián)系調(diào)查兒童家長，了解大便標(biāo)本收集情況及不良反應(yīng)發(fā)生情況，并按調(diào)查對象住址每天上門取一次大便標(biāo)本。收集的標(biāo)本置-20℃冰箱冷凍保存。標(biāo)本收集情況和不良反應(yīng)情況錄入電腦以供分析。
　　 4.大便標(biāo)本的檢

10、測分析所有收集的大便標(biāo)本將按調(diào)查兒童和調(diào)查天數(shù)進(jìn)行歸類和排序。然后進(jìn)行酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunoadsordent assay，EIA)檢測大便標(biāo)本中是否含有輪狀病毒抗原。檢測試劑盒為英國Oxoid Ltd公司出品的輪狀病毒檢測試劑盒，該試劑盒有96個反應(yīng)孔，一次可做94份標(biāo)本。標(biāo)本首先融解，然后取樣并加入病毒保存液溶解，最后按照EIA試劑盒說明書在反應(yīng)孔中操作。結(jié)果在酶標(biāo)儀上讀數(shù)，波長設(shè)定為450 nm。檢測

11、試標(biāo)本OD值-陰性對照OD值≥0.2為判讀陽性結(jié)果。每次試驗至少設(shè)有一孔陽性對照和一孔陰性對照。
　　 5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)基因型分析采用RT-PCR法分別檢測EIA陽性兒童的標(biāo)本以及部分隨機(jī)抽取的EIA陰性兒童標(biāo)本的人輪狀病毒和羊輪狀病毒，以鑒定兒童輪狀病毒排毒的基因型。人輪狀病毒的引物由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所腹瀉病研究室提供;LLR基因片段全長在GenBank database上下載，運用pri

12、mer5.0進(jìn)行引物設(shè)計。針對羊輪狀病毒分型，共設(shè)計了2對引物，一對用來鑒定G基因型，一對用來鑒定 P基因型。 G基因分型上游引物 LLR-VP7F，5，-TGAGTGGACGAGTACATTGT-3'，下游引物 LLR-VP7R，5'-AATGGTCAAGTCGTGGTAG-3'，擴(kuò)增片段451bp。P基因分型上游引物為5'-GAT GCT TCT AGC ACC AAC ATC AG-3'，下游引物L(fēng)LR-VP4R，5'-CAG T

13、GAATG GAG TGA ACG AC-3'，擴(kuò)增片段513bp。羊輪狀病毒疫苗毒株基因全長來自GeneBank，其中VP7片段接收編號為HM800948，VP4接收編號為JQ013506。運用單提RNA的試劑提取輪狀病毒核酸，然后進(jìn)行預(yù)變性，再運用RT-PCR試劑盒做核酸擴(kuò)增，最后在1％的瓊脂糖膠中電泳。陽性標(biāo)本的RP-PCR產(chǎn)物送北京市睿博生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。
　　 結(jié)果：

14、　　 1.人口統(tǒng)計學(xué)分析2011年9月～2012年10月間，共登記首次接種疫苗兒童121人，其中1人失訪，5人中途退出且無大便標(biāo)本收集。有標(biāo)本收集的兒童共115人，共收集標(biāo)本1172份。男女比例為1.12∶1。
　　 2.輪狀病毒抗原檢測1172份大便標(biāo)本經(jīng)EIA檢測，有38(3.2％)份為陽性;115位調(diào)查兒童中EIA陽性兒童為16(13.9％)人。在為期14天的調(diào)查中，排毒最早發(fā)生在接種疫苗后第1天，最晚發(fā)生在服苗后的第1

15、3天。其中32(82％)份EIA陽性標(biāo)本集中在服苗后的第5～10天，意味著排毒高峰期為服苗后第5～10天。平均持續(xù)排毒時間為3天，其中僅排毒1天有6(37.5％)人。平均排毒量OD值為0.62，羊輪狀病毒疫苗排毒量約為3.9×105～1.6×106拷貝/ml，平均排毒量約為7.8×105拷貝/ml。
　　 3.RT-PCR基因型分析對16位EIA陽性兒童的177份標(biāo)本和隨機(jī)抽取的7位EIA陰性兒童的61份標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR檢測

16、。人輪狀病毒RT-PCR篩查結(jié)果顯示均為陰性，未見調(diào)查對象有偶合感染人輪狀病毒的情況。羊輪狀病毒疫苗毒株篩查結(jié)果顯示EIA陰性兒童標(biāo)本中均為陰性。177份EIA陽性兒童標(biāo)本中，VP7片段陽性101(57.1％)份，VP4片段陽性103(58.2％)份，兩基因片段合并陽性111(62.7％)份。RT-PCR陽性結(jié)果送測序公司測序，結(jié)果顯示VP7片段的符合率為96％，VP4片段的符合率為99％，均為羊輪狀病毒疫苗的目的片段。
　　

17、4.安全性分析在跟蹤隨訪的14天內(nèi)，115位調(diào)查兒童有8(7％)人發(fā)生了一過性的輕微不良反應(yīng)。其中有5人發(fā)生了一過性的輕微發(fā)熱，3人發(fā)生了腹瀉，1人精神萎靡（其中一人同時發(fā)生了發(fā)熱和腹瀉癥狀），未見嚴(yán)重的腸套疊和其他明顯的臨床癥狀的發(fā)生。與調(diào)查兒童接觸的家庭成員（Household contacts，HHC）共有442人，僅有1人在調(diào)查期間發(fā)生了腹瀉癥狀，對該腹瀉患者腹瀉期間收集的7份大便標(biāo)本經(jīng)EIA和RT-PCR檢查，未見輪狀病毒疫苗

18、毒株的排出。
　　 結(jié)論：
　　 1.我國羊輪狀病毒疫苗在首次接種疫苗后14天內(nèi)的排毒率為13.9％，95％可信區(qū)間為8.1～21.6％;兒童首次接種疫苗后的14天內(nèi)均有可能發(fā)生排毒，其中排毒高峰期為接種疫苗后第5～10天;排毒持續(xù)時間最少僅1天，最長的有6天，平均排毒持續(xù)時間為3天。平均排毒量的OD值為0.62，約為7.8×105拷貝/ml?？梢娧蜉啝畈《疽呙绲呐哦韭实?，排毒持續(xù)時間短，排毒量小。
　　 2.研

19、究顯示年齡為影響疫苗排毒的重要因素，其中2～12月齡調(diào)查兒童的疫苗排毒率為20.5％，13～24月齡調(diào)查兒童的疫苗排毒率為13％，25～36月齡調(diào)查兒童未見疫苗排毒。可見隨著年齡的增長，疫苗排毒率顯著降低。性別因素對疫苗排毒無影響。
　　 3.對EIA陽性兒童做RT-PCR分析，排毒毒株基因型均為G10P[15]，排毒毒株為蘭州羊輪狀病毒疫苗;未見調(diào)查對象在調(diào)查期間偶合感染人輪狀病毒的情況。
　　 4.不良反應(yīng)的發(fā)生率為