慢性阻塞性肺疾病病人肺內(nèi)小動脈舒縮功能改變的研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預(yù)防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD的進展導(dǎo)致肺動脈高壓，其主要機制為缺氧性肺血管收縮、肺血管內(nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重塑。肺血管一系列病理生理改變是COPD病程進展中重要的組織病理改變，本研究通過比較正常病人及COPD病人肺血管對于不同藥物的反應(yīng)，探討COPD病人肺血管舒縮功能是否發(fā)生改變，為COPD病人

2、應(yīng)用藥物提供臨床依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 1、標本來源：本研究人體標本來源于2011年10月1日-2012年6月4日在廣東省肺癌研究所因肺癌行肺葉切除手術(shù)的病人。ASA分級Ⅰ～Ⅱ級。術(shù)前均告知病人標本采集過程與用途，并簽署標本采集知情同意書。本研究已通過廣東省醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理審批（粵醫(yī)科倫理2010079H號）。選取距離癌組織邊緣5cm以上的周圍正常肺組織作為實驗標本。所有病人均于術(shù)前7天內(nèi)行肺功能檢查。COP

3、D的確診標準參照2007年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》。依照肺功能檢查報告，以(FEV1/FVC)×100％＜70％作為標準，將病人分為對照組和COPD組。
　　 2、血管環(huán)制備肺組織：從病人身上切除后，洗凈殘血，將肺組織固定于裝有預(yù)冷的平衡液（Krebs-Henseleit液，K-H液）(4℃)的硅膠板上，顯微鏡下尋找直徑約0.5～1mm的肺內(nèi)小動脈，分離周圍粘連的肺組織及支氣管

4、、肺靜脈等。制備長度為1.5～2 mm的動脈環(huán)，用兩根直徑為40μm的不銹鋼絲穿過管腔。將血管固定于張力測定儀上，平衡60 min，期間每隔15 min更換K-H液1次，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力使其維持在1.8～2 mN。浴槽內(nèi)持續(xù)通入95％O2+5％CO2混合氣，溫度恒定在37℃，模擬人體內(nèi)環(huán)境。實驗中需制備機械損傷內(nèi)皮血管，用不銹鋼鋼絲在穿過血管腔時來回摩擦血管壁數(shù)次，以破壞血管內(nèi)壁上的內(nèi)皮細胞。
　　 3、血管功能性檢測
　　

5、 3.1檢測血管反應(yīng)性制備好的肺動脈環(huán)在浴槽中模擬人體內(nèi)環(huán)境平衡60min后，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2 mN，前負荷變化穩(wěn)定后把浴槽內(nèi)的K-H液換成預(yù)熱的60mmol/L高鉀溶液。60mmol/L高鉀使肺內(nèi)小動脈收縮，待血管收縮張力變化穩(wěn)定至一平臺期，以K-H液充分洗凈（沖洗4次，每次間隔5 min）至張力恢復(fù)至基線水平。平衡60 min后，重復(fù)上述步驟2次。以后兩次加入高鉀溶液前后平均血管張力改變幅度小于3mN作為反應(yīng)性差的界定標準，

6、反應(yīng)性差的血管舍棄不用。經(jīng)血管反應(yīng)性檢測，共納入130條血管作為實驗樣本，其中正常對照組67條，COPD組63條。
　　 3.2檢測血管對不同血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性平衡血管環(huán)60 min，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2 mN，前負荷變化穩(wěn)定后加入60mmol/L高鉀溶液，觀察并記錄血管張力變化幅度。以K-H洗凈，如前述平衡并調(diào)整前負荷后加入U46619100nmol/L，觀察并記錄血管張力變化幅度。以K-H洗凈后，如前述平衡并調(diào)整前負荷

7、后加入內(nèi)皮素(endothelin，ET-1)30nmol/L，觀察并記錄血管張力變化幅度。
　　 3.3檢測吲哚美辛孵育后對U46619作用的影響16條經(jīng)高鉀溶液檢測后血管活性好的血管（對照組9條，COPD組7條），張力恢復(fù)至基線水平后平衡血管環(huán)60 min，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2 mN，前負荷變化穩(wěn)定后加入U46619100nmol/L，反應(yīng)穩(wěn)定后以K-H洗凈，張力恢復(fù)至基線水平后平衡血管環(huán)60 min，然后加入吲哚美辛1

8、0μmol/L孵育30min，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2 mN，前負荷變化穩(wěn)定后再次加入U46619100nmol/L，反應(yīng)穩(wěn)定后，以K-H洗凈，觀察并記錄上述過程中血管張力的變化。
　　 3.4測定丙泊酚對靜息狀態(tài)下人肺內(nèi)小動脈的作用選取24條肺功能正常病人的肺血管環(huán)，以不同方式處理內(nèi)皮，在K-H液中平衡60min，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.8～2.0mN，前負荷變化穩(wěn)定后累積加入丙泊酚1、3、10、30、100、300、1000μmo

9、l/L，記錄張力的變化。
　　 3.5測定血管內(nèi)皮完整性及丙泊酚對人肺內(nèi)小動脈作用與血管內(nèi)皮的相關(guān)性選取24條肺功能正常病人的肺血管環(huán)，按照隨機數(shù)表法將其分為3組，分別為內(nèi)皮完整組（N組）、機械去內(nèi)皮組（D組）、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制內(nèi)皮功能組（L組）。N組不予任何處理;D組用不銹鋼鋼絲摩擦損傷內(nèi)皮細胞;L組血管加入L-NAME10μmol/L孵育30min。調(diào)整前負荷后加入U46619100nmol/L收縮血管

10、，待血管張力平衡后加入乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)1μmol/L。若血管舒張幅度大于60％，視為內(nèi)皮完整;若舒張幅度＜60％，視為去除內(nèi)皮。以K-H液洗凈上述經(jīng)內(nèi)皮完整性檢測的肺動脈血管環(huán)，張力恢復(fù)至基線水平后平衡血管環(huán)60 min，加入U46619100nmol/L預(yù)收縮3組血管，張力穩(wěn)定后累積加入丙泊酚1、3、10、30、100、300、1000μmol/L，記錄張力的變化，觀察丙泊酚對預(yù)收縮肺內(nèi)小動脈的作用及其作

11、用與內(nèi)皮完整程度的相關(guān)性。
　　 3.6測定丙泊酚對預(yù)收縮人肺內(nèi)小動脈的作用選取42條肺動脈環(huán)，其中正常對照組22條，COPD組20條。分別先后加入60mmol/L高鉀溶液、U46619100nM/L、ET-130nM/L預(yù)收縮血管，藥物引起預(yù)收縮張力達到穩(wěn)定值后累積加入丙泊酚1、3、10、30、100、300、1000μmol/L，同時選取正常及COPD病人肺動脈環(huán)各4條加入等體積丙泊酚溶劑DMSO作空白對照，觀察并記錄張力的

12、變化。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)處理：測試肺內(nèi)小動脈對血管收縮劑反應(yīng)性時，以60mmol/L高鉀溶液誘發(fā)的血管最大收縮幅度為100％，加入藥物后血管收縮與最大收縮幅度的比值反映血管張力的變化。以兩組吲哚美辛孵育前后下降或上升百分比來反映血管張力的變化。測試丙泊酚對肺內(nèi)小動脈的作用時，以藥物預(yù)收縮誘發(fā)的血管最大收縮幅度為100％，加入藥物后血管舒張與最大收縮幅度的比值反應(yīng)血管張力的變化，Emax表示最大舒張或收縮百分比，EC50表示產(chǎn)生5

13、0％最大舒張效應(yīng)時對應(yīng)的藥物濃度，pD2=-1g(EC50)，表示引起最大效應(yīng)的一半時所需的藥物摩爾濃度的負對數(shù)，量效曲線應(yīng)用GraphPad(prism3.0)繪制和分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS13.0。兩組間計數(shù)資料比較用卡方檢驗，兩組間計量資料比較用獨立樣本t檢驗，孵育前后張力改變百分比分別用單樣本t檢驗。丙泊酚作用與內(nèi)皮相關(guān)性實驗中，三組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，三

14、組間舒張率比較用重復(fù)測量方差分析，三組間舒張率與內(nèi)皮舒張率的關(guān)系用直線相關(guān)分析。丙泊酚舒張正常及COPD病人肺內(nèi)小動脈實驗中，兩組間舒張率比較用重復(fù)測量方差分析。以p＜0.05作為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.U46619對通氣功能正常病人與COPD病人肺內(nèi)小動脈的作用
　　 U46619引起對照組(n=20)與COPD組(n=20)肺內(nèi)小動脈持續(xù)性收縮，直至達到張力穩(wěn)定的平臺期。對照組與COPD組對U

15、46619引起的收縮張力變化的絕對值均數(shù)分別為7.68±2.31 mN、5.89±2.43mN，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，p＜0.05。對照組、COPD組與高鉀溶液收縮幅度的標準比值分別為137％±28％、118％±40％，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，p＜0.05。
　　 2.ET-1對通氣功能正常病人與COPD病人肺內(nèi)小動脈的作用
　　 ET-1引起對照組(n=20)與COPD組(n=20)肺內(nèi)小動脈持續(xù)性收縮，直至達到張力穩(wěn)定

16、的平臺期。兩組對ET-1引起的收縮張力變化的絕對值均數(shù)分別為5.97±2.08mN、3.99±2.15mN，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，p＜0.01。對照組、COPD組與高鉀溶液收縮幅度的標準比值分別為113％±34％、81％±35％，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，p＜0.01。
　　 3.60mmol/L高鉀溶液對通氣功能正常病人與COPD病人肺內(nèi)小動脈的作用
　　 高鉀溶液引起對照組(n=20)與COPD組(n=20)肺內(nèi)小動脈持

17、續(xù)性收縮，直至達到張力穩(wěn)定的平臺期。兩組病人對高鉀溶液引起的張力變化均數(shù)分別為5.65±1.70mN、5.02±1.38mN，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.吲哚美辛孵育對U46619收縮肺內(nèi)小動脈的影響
　　 吲哚美辛孵育前后，U46619均能引起肺內(nèi)小動脈收縮。對照組(n=9)孵育前張力為5.23±2.80mN，孵育后為2.67±1.65 mN，以孵育前后差值與孵育前血管張力的比值反映張力變化，孵育后張力下降百分比

18、39％，單樣本t檢驗孵育前后比較有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01。COPD組(n=7)孵育前張力為5.21±1.85mN，孵育后為4.28±3.09mN，以孵育前后差值與孵育前血管張力的比值反映張力變化，孵育后張力上升百分比5％，單樣本t檢驗孵育前后比較無統(tǒng)計學(xué)意義，p＞0.05。吲哚美辛孵育前后，正常組與COPD組張力變化幅度無明顯差異，獨立t檢驗比較p＞0.05。
　　 5.丙泊酚對靜息狀態(tài)下人肺內(nèi)小動脈的影響
　　 在基

19、礎(chǔ)張力1.8-2.0mN的靜息狀態(tài)下，濃度1～1000μmol/L的丙泊酚對不同方式處理內(nèi)皮的正常病人的肺內(nèi)小動脈(N組(n=8):內(nèi)皮完整組;D組(n=8):機械去內(nèi)皮組;L組(n=8):L-NAME阻斷內(nèi)皮組）不引起收縮或舒張效應(yīng)。
　　 6.內(nèi)皮對丙泊酚舒張人肺內(nèi)小動脈的影響
　　 以不同方式處理血管內(nèi)皮，丙泊酚均能呈濃度依賴性舒張U46619預(yù)收縮的肺內(nèi)小動脈。經(jīng)重復(fù)測量方差分析，三組間舒張率不全相等。經(jīng)LSD兩

20、兩比較，N組與D組舒張幅度無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，p=0.392＞0.05，L組舒張幅度與N組、D組相比，分別有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，p分別為0.003和0.019。經(jīng)計算各組內(nèi)皮舒張率分別N組=（85.52±11.51）％;D組=（42.04±6.22）％;L組=（22.81±8.79）％。Emax: N＞D＞L。內(nèi)皮舒張率:N＞D＞L。對24例標本進行雙變量相關(guān)分析，二者相關(guān)系數(shù)r=0.872，p=0.000，兩者存在顯著正相關(guān)關(guān)系。
　

21、　 7.丙泊酚對預(yù)收縮人肺內(nèi)小動脈的作用
　　 丙泊酚能舒張由60mmol/L高鉀溶液、U46619、ET-1預(yù)收縮的肺功能正常病人和COPD病人肺血管，其舒張效應(yīng)呈濃度依賴性。無論是非受體依賴的高鉀溶液，或是受體依賴的U46619和ET-1預(yù)收縮的肺動脈環(huán)，30μmol/L的丙泊酚開始對其產(chǎn)生舒張作用，隨著丙泊酚累積濃度增加，其舒張效應(yīng)也逐漸增強。丙泊酚的舒張肺內(nèi)小動脈呈明顯的量效依賴關(guān)系，舒張幅度與丙泊酚藥物濃度成正比。當

22、丙泊酚累積濃度超過300μmol/L時，量效曲線圖坡度變緩，反映超出300μmol/L丙泊酚舒張血管幅度不再大幅增加。丙泊酚對高鉀溶液預(yù)收縮的COPD病人肺動脈環(huán)舒張幅度較正常對照組病人下降，p＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.COPD病人肺內(nèi)小動脈對外源性血栓素類似物U46619及內(nèi)皮素ET-1反應(yīng)性較正常人下降。
　　 2.COPD病人肺內(nèi)小動脈收縮功能下降的機制可能與COPD發(fā)生發(fā)展過程中機體長期耐受內(nèi)