胃癌相關基因GCRG213對胃癌種植瘤的影響及與APE的相關性.pdf

1、[背景]胃癌相關基因GCRG213是我們實驗室篩選出的一條在腸型胃癌組織、癌旁和正常組織間差異表達的新基因，初步研究表明：該基因與人體內(nèi)無嘌呤無嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic/apyrimidinicendonuclase，APE/Ref-1)序列有61％同源性并且含有其保守的功能位點；用其正、反義克隆及小干擾RNA片段轉(zhuǎn)染人胃癌細胞系MKN45細胞后，能分別增加和減弱細胞的生長速度和成瘤性。本實驗在此基礎上對GCRG213進行進一步

2、研究，同時為胃癌的基因治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。利用本實驗室構建好的一套胃癌組織芯片，我們還對胃黏膜組織中APE的表達進行了初步分析。 隨著生物技術的發(fā)展，腺相關病毒(AAV)載體成為目前載體工具研究的熱點，同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體比較，它具有無致病性、無免疫原性、能感染分裂期和非分裂期細胞、能穩(wěn)定整合到宿主細胞內(nèi)長期表達等優(yōu)點，有望成為人體基因治療和基因功能研究最理想的載體工具。 [目的]1.觀察GCRG213正

3、、反義克隆和shRNA干擾片段體內(nèi)轉(zhuǎn)染對裸鼠胃癌種植瘤生長的影響，分析GCRG213功能；2.比較GCRG213和APE蛋白表達水平，分析兩者是否相關；3.研究APE在胃癌組織的表達狀況及與臨床病理因素和胃癌患者預后的關系。 [方法]1.用pAAVHelper-freesystem包裝含GCRG213正、反向DNA片段的腺相關病毒：設計針對GCRG213有效讀框(ORF)的特異性引物，并根據(jù)病毒包裝載體上特異性酶切位點，在引物兩

4、端分別引入相應內(nèi)切酶識別位點，從pGEM-T質(zhì)粒上擴增出GCRG213的DNA片段，按正、反向克隆入包裝載體上，檢測無誤后，同pHelper質(zhì)粒、pRC質(zhì)粒一起用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細胞，分別包裝出含GCRG213正、反向DNA片段的腺相關病毒。 2.包裝含shRNA干擾片段的腺相關病毒：從含干擾效率相對較高RNAi片段的IMG-800質(zhì)粒上選擇特異性酶切位點，連同U6啟動子一起切下RNAi片段，插入病毒包裝載體，包裝出

5、含U6啟動子和RNAi片段的腺相關病毒。 3.用MKN45細胞接種裸鼠皮下，成瘤后分別用上述病毒行腫瘤局部注射，并設立空病毒和空白對照，觀察腫瘤生長狀況。處死大鼠后比較各組腫瘤大小，并用RT-PCR檢測腫瘤組織GCRG213mRNA表達水平。 4.用免疫組化的方法，分別對正常胃黏膜組織(非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎)活檢標本、胃癌組織手術標本、正常胃黏膜上皮細胞、胃癌上皮細胞進行GCRG213和APE蛋白表達的檢測，比較同一

6、組織或細胞中兩種蛋白的表達部位、表達水平，分析兩者的相關性。 5.對轉(zhuǎn)染了GCRG213正、反向克隆和RNAi片段后GCRG213表達水平分別增強或減弱的MKN45-213a細胞、MKN45-213b細胞和MKN45-213i-2細胞進行APE免疫組化研究，同MKN45細胞比較，用Image-ProPlus圖象分析軟件檢測四種細胞中APE蛋白表達水平，觀察GCRG213表達變化是否對APE表達有影響。 6.用本室構建好的

7、胃癌組織芯片進行APE免疫組化研究，分析不同胃黏膜組織中APE表達水平和表達變化的特征及其與胃癌臨床病理因素和胃癌患者預后的關系。 [結果]1.我們成功包裝出含GCRG213正、反向克隆的腺相關病毒 rAAV-GCRG213s、rAAV-GCRG213a，病毒滴度為4×1010v.g./ml。通過對病毒載體酶切位點的分析，實現(xiàn)了對病毒載體的改造，構建了含U6啟動子和GCRG213-RNAi片段的質(zhì)粒，并包裝出含U6啟動子

8、和GCRG213-RNAi片段的腺相關病毒rAAV-U6-shRNA，病毒滴度為5×1012v.g./ml，該質(zhì)粒有望用于其他癌基因的體內(nèi)RNAi實驗。 2.用包裝的病毒對裸鼠皮下種植瘤行局部注射后，實現(xiàn)了目的基因和shRNA干擾片段的體內(nèi)表達。同注射rAAV-GFP腺相關病毒的空病毒對照組和注射生理鹽水的空白對照組比較：注射正向克隆的腺相關病毒rAAV-GCRG213s裸鼠腫瘤生長較快，GCRG213mRNA表達水平較高；注射

9、反向克隆的腺相關病毒rAAV-GCRG213a和注射含shRNA干擾片段的腺相關病毒rAAV-U6-shRNA裸鼠腫瘤生長減慢，GCRG213mRNA表達水平相對較低。 3.在胃黏膜組織中GCRG213著色比較彌散，以胞漿表達為主，胞膜和間質(zhì)有表達，胞核著色少見。APE在正常胃黏膜(非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎)中主要在胞核表達，在胃癌組織則在漿核都有表達，兩者表達的部位和程度沒有明確的相似性，但在個別APE和GCRG213都有胞漿

10、表達的胃癌患者中，其非癌組織的胞漿表達都呈現(xiàn)一種從深層到淺層逐漸減弱的趨勢。 4.APE在HFE-145細胞中主要是細胞核陽性表達，在GES-1細胞核呈弱陽性表達，分裂期細胞核陽性表達明顯，在SGC-7901細胞以胞核表達為主，個別細胞有胞漿表達，在MKN45細胞也主要是核陽性表達。GCRG213在上述細胞中仍以胞漿表達為主，無明顯核表達。 5.MKN45-213a細胞、MKN45-213b細胞、MKN45-213i-2

11、細胞的APE表達水平同MKN45細胞比較，灰度值分別為121.586±8.290、124.783±11.436、127.776±6.036、139.678±10.987，無明顯差異。 6.APE在正常、胃癌和轉(zhuǎn)移淋巴結組織中均有胞核表達、胞漿表達、漿核均表達三種表達模式。在正常組織中，胞核陽性率為96.6％，胞漿陽性率為71.8％，漿核均陽性率為71.4％；在胃癌組織中，胞核陽性率為97.1％，胞漿陽性率為21.4％，漿核均陽性

12、為21.4％，；在轉(zhuǎn)移淋巴結中，胞核陽性率為98.9％，胞漿陽性率為10.0％。 胃癌組織同正常組織比較，胞核陽性率變化不明顯，但陽性程度明顯較正常組織低，差異具有顯著性(X2=13.914，P=0.045)，其中有35.9％患者核表達輕度減弱，11.2％患者核表達明顯減弱。胞漿表達在胃癌組織也明顯較正常組織弱，兩者比較差異也具有顯著性(X2=13.524，P=0.035)，其中有42.4％患者漿表達輕度減弱，21.4％患者漿表

13、達明顯減弱。 正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中細胞核、細胞漿APE表達水平與臨床各病理因素之間沒有明確相關性，胃癌組織中胞核表達與腫瘤浸潤深度(P=0.000)、有無淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.010)、TNM分期(P=0.000)有明顯相關，浸潤深度越深、出現(xiàn)淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期越晚，則胞核表達越弱，胞核表達還顯示出與性別有一定相關性，男性表達水平較女性高(P=0.048)，胞漿表達水平則與性別無明確相關性，只顯示與淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.017

14、)和TNM分期(P=0.019)有關，有淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的患者胞漿表達水平較弱。 腫瘤組織同正常組織比較，胞核、胞漿APE表達減弱水平與臨床各病理因素之間相關性分析顯示：胞核表達減弱水平與浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期有明顯相關，與性別也有明顯相關，女性減弱的比率較男性高；胞漿減弱水平與淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期明顯相關。 APE在正常胃組織、腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的表達狀況及表達程度的變化與患者預后未顯示統(tǒng)計學

15、相關。 [結論]1.用腺相關病毒載體能有效實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)正、反義表達。插入U6啟動子的腺相關病毒載體能有效實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)RNA干擾。 2.GCRG213是一種促癌因子，其表達水平升高或降低后，能促進或抑制胃癌的生長。 3.GCRG213以胞漿表達為主，APE以胞核表達為主，胞漿胞核都有表達。從蛋白表達水平分析，GCRG213和APE沒有肯定的相關性。 4.APE在胃黏膜組織中表達的陽性率極高，胞漿