納絡酮與加蘭他敏對東莨菪堿所致大鼠空間學習記憶障礙的作用.pdf

1、背景與目的:中樞膽堿能系統(tǒng)被證明是影響學習和記憶的重要神經(jīng)系統(tǒng),已有資料表明,中樞乙酰膽堿(Ach)是學習記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì),主要證據(jù)是M-膽堿受體阻斷劑東莨菪堿能使大腦乙酰膽堿含量下降,并導致記憶障礙,而膽堿酶抑制劑(AchE)能增強記憶,到目前為止,治療老年性癡呆(AD)最有效的方法是膽堿酯酶制劑。它保護AD病人大腦中正在減少的Ach數(shù)量,改善AD病人記憶。
　　有關阿片類藥物成癮及其脫毒治療的相關研究發(fā)現(xiàn)阿片系統(tǒng)也參與和調(diào)制

2、學習記憶的過程.許多實驗研究證明嗎啡降低額葉皮層、隔區(qū),海馬等部位細胞外Ach,其是,至少是部分抑制了中樞膽堿能神經(jīng)元活力而損害學習記憶。非選擇性阿片受體拮抗劑納絡酮能夠逆轉(zhuǎn)這種作用。納絡酮有利于記憶的保持、鞏固,微腦透析實驗發(fā)現(xiàn),納絡酮能顯著增加海馬Ach的釋放,并呈劑量依賴性。可能通常情況下阿片系統(tǒng)對膽堿能神經(jīng)元有緊張性抑制作用,納絡酮解除了阿片肽對乙酰膽堿釋放的抑制。阿片系統(tǒng)和膽堿能系統(tǒng)對學習記憶影響的機制尚不清楚。
　　乙

3、酰膽堿主要在神經(jīng)末梢合成,其合成的關鍵酶是膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)。ChAT在神經(jīng)元胞體合成,籍軸突運輸運送到神經(jīng)末梢的胞漿中。是否阿片系統(tǒng)對膽堿能神經(jīng)元胞體ChAT的合成或軸突ChAT的運輸或神經(jīng)末梢ChAT活性存在影響,對神經(jīng)元突觸可塑性有何影響,目前尚未見文獻報道。
　　基于以上理論及資料,納洛酮改善東莨菪堿所致學習記憶障礙與其促進乙酰膽堿在突觸的釋放有關,本課題擬對其機制進行一些探討:納洛酮是否對ChAT的合成或者運輸有

4、影響,對學習記憶相關的神經(jīng)元突觸可塑性有何影響。從而為納洛酮改善老年性癡呆的臨床應用提供理論依據(jù),為進一步闡明在學習記憶過程中阿片系統(tǒng)對膽堿能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制進行有益的探索。同時比較納洛酮和加蘭他敏對東莨菪堿所致大鼠學習記憶障礙的改善效果。
　　材料和方法:
　　實驗一 Morris水迷宮工作記憶試驗
　　2月齡SD大鼠56只按Morris水迷宮工作記憶試驗方法訓練,通過訓練,每只大鼠表現(xiàn)穩(wěn)定,隨機分成4組(n=14):

5、正常對照組、東莨菪堿組、納洛酮治療組(東莨菪堿+納洛酮)和加蘭他敏治療組(東莨菪堿+加蘭他敏)。東莨菪堿按0.4mg/kg、納洛酮按3mg/kg,加蘭他敏按2 mg/kg,正常對照組予等量生理鹽水,均在實驗前30分鐘腹腔給藥,然后開始水迷宮延緩性匹配作業(yè),記錄每只大鼠前后兩次逃避潛伏期。四組大鼠各取半數(shù)(n=7),1.5小時后重復Morris水迷宮工作記憶實驗,以觀察納洛酮治療效果持續(xù)時間。
　　采用免疫組化方法和計算機圖像分析技

6、術定量檢測大鼠海馬CA1、CA3區(qū)和前額葉皮層區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT),透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)錐體細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　實驗二 Morris水迷宮參照記憶試驗
　　1月齡 SD大鼠14只,隨機分為正常對照組、東莨菪堿模型組(n=7),東莨菪堿模型組大鼠每天皮下注射東莨菪堿2mg/kg,一天兩次,正常對照組予等量生理鹽水,連續(xù)21天。然后按Morris水迷宮參照記憶試驗方法,觀察定位航行、空間探索和可見平臺實驗。
　

7、　采用Nissl染色法進行海馬CA1、CA3區(qū)錐體細胞計數(shù),常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色進行海馬CA1、CA3區(qū)組織病理學觀察,透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)錐體細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　實驗一結(jié)果:
　　四組大鼠空間工作記憶結(jié)果,前后逃避潛伏期比較:正常組呈極顯著性差異(p<0.001),東莨菪堿組無差異(P>0.05),說明工作記憶受損害;納洛酮治療組呈顯著性差異(p<0.05

8、),說明東莨菪堿所致工作記憶損害得到明顯恢復;加蘭他敏治療組仍無差異(P>0.05),說明受到損害的工作記憶并無改善。四組Trial1逃避潛伏期比較:其他三組與正常組比較(Dunnett T test),均無顯著性差異,組間最大差異(LSD檢測)比較,東莨菪堿組、加蘭他敏治療組顯著小于正常組(p<0.05),東莨菪堿組、納洛酮治療組和加蘭他敏治療組間無差異。
　　膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的灰度、陽性單位數(shù)、陽性單位/面積在四組大

9、鼠海馬 CA1、CA3區(qū)錐體細胞和前額葉皮層無顯著性差異(P>0.05);其他三組與正常組比較(Dunnett T test),均無顯著性差異;組間最大差異(LSD檢測)比較亦無顯著性差異。說明各組CA1、CA3區(qū)錐體細胞、前額葉皮層神經(jīng)元ChAT量、ChAT表達陽性數(shù)目及密度無差別。
　　四組大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的變化:四組大鼠錐體細胞胞體細胞核及細胞器正常,但CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)有明顯變化,正常組突觸間隙清晰,囊泡大

10、小均一,并向突觸前膜聚集,突觸后致密物質(zhì)均勻,致密。東莨菪堿組突觸前后膜模糊,融合,間隙不清;囊泡明顯大小不一,突觸前膜處聚集明顯,密度增加,遠隔處囊泡大而稀疏,突觸后致密物質(zhì)不均、模糊,邊界朦朧。納絡酮組,突觸間隙清楚,囊泡大小均一,稀疏,向突觸前膜聚集,突觸后致密物質(zhì)均勻,邊界整齊清楚。加蘭他敏組,突觸間隙清楚,但前后膜模糊似有融合;囊泡大小欠均一,分布彌散,無明顯突觸前膜聚集現(xiàn)象,突觸后致密物質(zhì)欠均勻,邊界欠清晰。四組大鼠CA1區(qū)

11、神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)明顯改變提示突觸可塑性變化,與行為學變化相一致。
　　納洛酮治療效果持續(xù)時間結(jié)果:四組(n=7)大鼠1.5小時后重復Morris水迷宮工作記憶實驗,前后逃避潛伏期比較:納洛酮治療組差異無顯著性(P>0.05),同東莨菪堿組、加蘭他敏治療組,說明1.5個小時后納洛酮改善工作記憶的作用消失。
　　實驗二結(jié)果:
　　定位航行實驗:兩組大鼠成績均隨學習次數(shù)的增加每天呈進步趨勢,東莨菪堿組逃避潛伏期在第3天大于

12、正常組,差異呈顯著性(p<0.05),但第4、5天成績與正常組無顯著性差異,第5天幾乎完全相同。運動軌跡在四個象限隨機分布相似,表明其搜索隱匿平臺策略相似。
　　正常組學習記憶情況有明顯的規(guī)律性,隨學習次數(shù)的增加,成績也明顯好轉(zhuǎn),每天均有明顯進步,東莨菪堿組并不像正常組一樣穩(wěn)定,但仍呈好轉(zhuǎn)趨勢,并在第5天與正常組一致。
　　說明東莨菪堿對大鼠定位航行實驗成績有輕度損害,但影響不大。
　　空間探索實驗:兩組間無顯著性差異

13、(P>0.05)。均在前4天記憶保持較好,第5天突然下降。說明東莨菪堿對長時記憶無影響。
　　可見平臺實驗:可見平臺逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)。說明東莨菪堿對大鼠視覺、感覺、運動及動機無影響。
　　兩組大鼠Nissl染色錐體細胞數(shù)比較,錐體細胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。
　　HE染色東莨菪堿組海馬CA1、CA3區(qū)未見組織病理學改變。
　　兩組大鼠超微結(jié)構(gòu):錐體細胞核及細胞器無差異,但CA1區(qū)神經(jīng)

14、元突觸有輕微變化。正常組突觸間隙清楚,囊泡大小均一,豐富,分布均勻,突觸后致密物質(zhì)濃密。東莨菪堿組突觸間隙清晰,囊泡大小均一,但數(shù)量較少,在突觸前膜處稀疏聚集,突觸后致密物質(zhì)較淺淡。CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)改變提示突觸可塑性有輕微變化,與行為學變化一致。
　　結(jié)論:
　　1.東莨菪堿一次性給藥能顯著損害大鼠空間工作記憶,納絡酮明顯改善該損害,其機制可能并非是納絡酮增加ChAT活性,而是促進神經(jīng)元突觸囊泡Ach向突觸間隙大量