惡性瘧原蟲重組蛋白次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶免疫原性及免疫保護作用的研究.pdf

1、瘧疾目前仍然是嚴重威脅人類健康的寄生蟲病,據(jù)WHO最新估計,全球仍有41％的人生活在瘧疾流行區(qū),每年死亡人數(shù)達三百萬。 隨著瘧原蟲及其蚊媒的抗藥性日益增強,迫切需要研制高效的瘧疾疫苗。但由于瘧原蟲生活史復(fù)雜、抗原變異性大等原因,單價疫苗免疫效果并不理想。因此,研青《復(fù)合多價疫苗成為預(yù)防瘧疾的一條潛在的有效途徑。而多價疫苗應(yīng)包含瘧原蟲的多個能夠發(fā)揮保護性體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答作用的抗原表位(T細胞表位和B細胞表位),以更有效地

2、發(fā)揮免疫保護作用。但近年來所發(fā)現(xiàn)的針對紅內(nèi)期瘧原蟲感染的保護性抗原,絕大多數(shù)是針對保護性體液免疫的抗原。目前已鑒定了具有細胞免疫保護作用的抗原組分一惡性瘧次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanine xanthine phosphoribosyl transferase,HGXPRT)。HGXPRT是嘌呤核苷酸補救合成途徑中的一種酶。這種酶具有高度保守性,在哺乳動物及瘧原蟲體內(nèi)均存在,可催化5-磷酸

3、核糖焦磷酸(PRPP)與嘌呤反應(yīng)生成嘌呤核苷酸。 本實驗室已利用畢氏酵母系統(tǒng)表達并純化了惡性瘧HGXPRT重組蛋白,本研究在此基礎(chǔ)上,檢測HGXPRT重組蛋白對約氏瘧易感小鼠(C57BL/6小鼠)的免疫原性；對不同約氏瘧蟲株(P.yoelii17XL和P.yoelii17NL)感染的免疫保護作用；建立針對HGXPRT蛋白特異的T細胞品系,以確定其保護性細胞免疫的作用；從而為瘧疾疫苗的研制提供基礎(chǔ)資料。 為研究HGXPRT

4、重組蛋白的免疫原性,我們將HGXPRT重組蛋白與完全弗氏佐劑(complete freud's adjuvant CFA)乳化并免疫C57BL/6小鼠,并以不完全弗氏佐劑(incomplete freud's adjuvant IFA)乳化蛋白加強免疫兩次,設(shè)立小牛血清白蛋白(bovine serum albumin BSA)和PBS組作為對照組,并在每次免疫的前一天尾靜脈取血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清抗HGXPRT重組

5、蛋白抗體滴度；我們還將HGXPRT重組蛋白與CFA乳化并免疫Balb/c小鼠,設(shè)立BSA和PBS組作為對照組。加強免疫一次后,無菌取小鼠脾臟、淋巴結(jié),制備淋巴細胞懸液,通過[3H]標記的胸腺嘧啶摻入法來檢測淋巴細胞的增殖；采用流式細胞術(shù)分析淋巴細胞的表面分子(CD4,CD8)的表達及細胞因子IL-4和IFN-γ的分泌情況。 ELISA結(jié)果顯示：三次免疫的抗HGXPRT蛋白抗體滴度依次升高,至末次免疫時可達105以上(1.89×1

6、05)(與PBS組比較,P<0.05);淋巴細胞增殖實驗結(jié)果表明：經(jīng)HGXPRT重組蛋白刺激的淋巴細胞能夠發(fā)生增殖(與PBS組比較,P<0.05);通過流式細胞術(shù)檢測經(jīng)重組HGXPRT蛋白刺激后的淋巴細胞為能夠分泌IFN-γ、CD4+的Th1型淋巴細胞(>80％)。 為檢測重組HGXPRT蛋白的免疫保護作用,我們用P.yoelii 17XL和P.yoelii17NL分別感染經(jīng)第三次加強免疫10天后的C57BL/6小鼠,在感染后次

7、日起每日計數(shù)原蟲率和小鼠生存時間。結(jié)果顯示與對照組相比,重組HGXPRT蛋白能夠抑制P.yoelii17NL在小鼠體內(nèi)的增殖,延長小鼠生存時間,提高生存率；但對P.yoelii17XL,在本實驗中重組HGXPRT蛋白未顯示出明顯的免疫保護作用(P>0.1)。 為研究重組HGXPRT蛋白的保護性細胞免疫作用,我們建立了HGXPRT特異性的T細胞系及對照組BSA特異的T細胞系。對于P.yoelii17XL,我們采用SCID小鼠進行過

8、繼免疫攻擊實驗。以BSA特異的T淋巴細胞組、PBS組為對照組,結(jié)果表明：三組小鼠原蟲率均急速上升,原蟲率及生存時間組間比較無明顯差異(P>0.1)。提示重組蛋白HGXPRT特異的T細胞品系對P.yoelii17XL感染的SCID小鼠無明顯的保護作用。 對于P.yoelii17NL,我們分別采用裸鼠和NOD-SCID開展了過繼免疫攻擊實驗。BSA特異的T淋巴細胞組、PBS組為對照組,裸鼠和NOD-SCID小鼠實驗結(jié)果顯示：對照組原

9、蟲率上升急速,峰值出現(xiàn)早,生存時間短,而HGXPRT組原蟲率上升較為平緩,峰值出現(xiàn)晚,生存時間明顯延長(組間比較采用t檢驗,P<0.05)。結(jié)果表明重組HGXPRT蛋白特異CD4+Th1細胞系能夠?qū)Ω腥緋.yoelii17NL的小鼠產(chǎn)生保護性細胞免疫的作用。 綜上所述,本實驗室用畢氏酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)生的惡性瘧重組HGXPRT蛋白,具有一定的免疫原性,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體,而且能夠介導(dǎo)對感染P.yoelii17NL的小鼠產(chǎn)生c