次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷醫(yī)學(xué)模型兔的初步研究.pdf

1、和小鼠相比，兔在生理，解剖，進(jìn)化等方面和人類更接近；相對(duì)于其它家畜，兔飼養(yǎng)成本較少，是研究心血管系統(tǒng)、肺部疾病和代謝疾病的合適動(dòng)物模型。因此通過基因改造獲得人類疾病模型兔在醫(yī)學(xué)研究方面有著良好的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。近來，體細(xì)胞克隆兔的技術(shù)成功建立，使得通過RNA干擾技術(shù)或基因打靶技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)的結(jié)合來生產(chǎn)定點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)基因兔成為可能。 本論文主要致力于HGPRT基因缺陷醫(yī)學(xué)模型兔的建立，從而為HGPRT基因缺陷引起相關(guān)疾病

2、的機(jī)理和治療的研究提供了條件。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分成兩部分，第一部分，利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了針對(duì)HGPRT基因表達(dá)的shRNA干擾載體，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔成纖維細(xì)胞，獲得攜帶該干擾片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系克隆，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞克隆陽(yáng)性率為83.3％。RT-PCR及Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因干擾成纖維細(xì)胞系HGPRT mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯降低。最后以轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植，囊胚率為27.8％，和正常來源的成纖維細(xì)胞相

3、比較差異不顯著。第二部分，利用Red同源重組系統(tǒng)，首先在已經(jīng)篩選到含有兔全長(zhǎng)HGPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基礎(chǔ)上，通過Gap-Repair方式從此克隆上將一段47kb無啟動(dòng)子的HGPRT基因組片段(不含有第1個(gè)外顯子)克隆到pBACLinkSp質(zhì)粒上，產(chǎn)生pBACLinkSp-rHGPRT質(zhì)粒。然后基于pBACLinkSp-rHGPRT質(zhì)粒，設(shè)計(jì)不同的同源臂，從而刪除了HGPRT基因的不同編碼區(qū)，成功構(gòu)建了三個(gè)不

4、同的HGPRT基因打靶載體。同時(shí)對(duì)利用同源重組技術(shù)敲除不同大小的DNA片段的效率進(jìn)行了研究。 本研究發(fā)現(xiàn)通過RNAi可穩(wěn)定敲減兔成纖維細(xì)胞HGPRT基因的表達(dá)，然后以HGPRTRNAi轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，證實(shí)HGPRTRNAi轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞能夠支持克隆胚發(fā)育至囊胚階段，進(jìn)一步的胚胎移植正在進(jìn)行中；利用Red同源重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了三個(gè)不同的兔HGPRT基因打靶載體，HGPRT基因敲除成纖維細(xì)胞系的篩選和鑒定正