ATRA、EGF對人前列腺癌激素非依賴性Du145細胞增殖、凋亡及轉移表型的影響.pdf

1、本課題對一種已穩(wěn)定建株的激素非依賴性前列腺癌細胞Dul~,5分別加入增殖誘導劑EGF和分化誘導劑ATRA前后從細胞水平和分子水平兩個層面分別進行研究，探索分化和增殖誘導劑在前列腺癌增殖、轉移及凋亡中的作用。為將來采用分化誘導法或凋亡促進法治療激素非依賴性前列腺癌或預防前列腺癌的轉移提供一定的理論基礎。 全文分下列三個部分： 第一部分，ATRA、EGF對前列腺癌激素非依賴性細胞株Dul45細胞增殖的影響 本部分研究

2、Dul45細胞經(jīng)ATRA、EGF干預后，對細胞生長速率、細胞周期的影響及其相應的分子機理。同時也進一步研究了EGF促進細胞增殖的可能信號通路。結果如下： 1．MTT法檢測，ATRA使Dul45細胞的生長速率減慢，，EGF使Dul45細胞的生長速率加快。 2．流式細胞儀檢測顯示：ATRA主要抑制G1期細胞向S期轉換而抑制細胞增殖，使G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少，而EGF的作用相反。3．ATRA組細胞、EGF組細胞與

3、對照組細胞相比，細胞周期蛋白(cyclin)Dl、A和E及周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK2，CDK4的蛋白表達均無明顯變化；周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(CKI)中p16，p21的表達也無明顯區(qū)別，4．ATRA可促進p27的表達，與cyclinA／E-CDK2復合物相結合的p27的量也明顯上升，但p27的mRNA水平卻無明顯變化。EGF可抑制p27的表達，與cyclinA／E-CDK2復合物相結合的p27的量也明顯下降，但p27的mRNA

4、水平也無明顯變化。 5．ATRA處理組細胞與對照組細胞相比，磷酸化的Rb下調，非磷酸化的Rb相應增多。EGF處理組細胞與對照組細胞相比，磷酸化的Rb上調，非磷酸化的Rb相應減少。 6．PI-3K抑制劑LY294002不能消除EGF組細胞中p27的表達及Rb的磷酸化水平的差別，而MEK磷酸化的抑制劑PD98059則能消除這些差別，表明EGF由MEK-MAPK信號通路而非PI-3K-PKB通路調節(jié)p27的表達。 本部

5、分研究結果可以認為：ATRA主要通過促進p27的表達，使其對CDK2的抑制加強，引起CDK2活力減弱。抑制了Rb磷酸化及其DNA合成，從而使細胞停留在G1期。EGF主要通過抑制p27的表達，使其對CDK2的抑制減弱，引起CDK2活力增加?；罨腃DK2又使Rb磷酸化，最后磷酸化的Rb脫離與之結合的轉錄因子E2F，使后者轉移至核內，促進DNA合成，從而使細胞由G1期通過限制點而向S期轉化。EGF促進細胞增殖的作用主要通過MEK/MAPK信

6、號通路向細胞內傳導。 第二部分ATRA、EGF對前列腺癌激素非依賴性細胞株Dul45細胞凋亡的影響 本部分研究Dul45細胞經(jīng)ATRA、EGF干預后，ATRA、EGF調控Dul45細胞凋亡的分子機制，進一步研究了ATRA、EGF對Dul45細胞骨架蛋白F-actin的影響。結果如下： 1．流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Dul45細胞對40pMATRA處理48h后，凋亡比例明顯升高，表現(xiàn)為凋亡細胞峰(亞二倍體峰)的明顯出現(xiàn)及升

7、高，而用EGF處理組沒有明顯的凋亡峰。 2．A0染色后免疫熒光顯微鏡觀察顯示：ATRA處理組可出現(xiàn)明顯的凋亡小體。 3．磷酸化PKB-T308和Bad-S136的表達都是ATRAEGF組細胞，而抗凋亡的Bc卜2和Bc卜xL則下調，其變化趨勢與Bax相反。 5．EGF、ATRA處理Du

8、l45細胞中的p53，死亡受體凋亡通路中的Fas-L，F(xiàn)as的表達均無明顯改變。 6．經(jīng)ATRA處理后，Dul45細胞中被裂解后有活性的caspase-3片段顯著增多；EGF處理時，caspase-3的裂解產物極少，主要以無活性的酶原形式存在。 7．EGF組細胞中，細胞骨架蛋白一肌動蛋白F—actin表現(xiàn)為排列較為整齊，清晰，邊緣完整。Dul45細胞在ATRA作用下，F(xiàn)—actin的正常的結構被破壞呈稀疏、不規(guī)則、發(fā)散狀

9、排列，并且邊緣呈破損狀。。 從本部分的結果看來，ATRA作為一個凋亡誘導因子，主要通過抑制一些抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)及PKB的活性，和促進一些促凋亡蛋白(Bax、Bad)的表達。這些ATRA引起的抗凋亡蛋白的表達下調和促凋亡蛋白的表達增加活化了caspase-3，引起細胞結構的變化，推斷^TRA可能主要通過線粒體途徑由caspase-3途徑介導，并導致細胞骨架的破壞從而誘導的Dul45細胞的凋亡。而EGF的作用相

10、反，抑制了細胞的凋亡。 第三部分ATRA、EGF對前列腺癌激素非依賴性細胞株Dul45細胞轉移表型的影響 本部分研究Dul45細胞經(jīng)EGF,ATRA干預后，ATRA、EGF對Dul45細胞轉移表型的影響及相關的分子機制，結果如下： 1．ATRA可抑制Dul45細胞對Fn的黏附能力；EGF可促進Dui45細胞對纖連蛋白(Fn)的黏附能力。 2．ATRA可抑制Dul45細胞對HUVEC的黏附能力；EGF可促進

11、Dul45細胞對-人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)的黏附能力。 3．ATRA可抑制Dul45細胞的遷移和侵襲能力；EGF可促進Dul45細胞的遷移力(Transwell法和劃痕法)。 4．ATRA可抑制Dul45細胞的侵襲能力；EGF可促進Dul45細胞的侵襲能力(Transwell法)。 5．EGF處理使Dui45細胞中整聯(lián)蛋白α5βl中β1亞基蛋白的表達顯著增加(westernblot、流式細胞檢測法)，M

12、APK信號通路抑制劑PD98059可使Dul45細胞中整聯(lián)蛋白α5β1中β1亞基蛋白的表達下調。 6．EGF處理使Dui45細胞中整聯(lián)蛋白α5β1中βl亞基mRNA的表達上調；MAPK信號通路抑制劑PD98059可使Dul45細胞中整聯(lián)蛋白僅5β1中β1亞基mRNA的表達下調；(RT-PCR檢測)。 從本部分的結果看來，ATRA處理使Dul45細胞粘附和遷移、侵襲能力增明顯降低，而EGF能促進Dul45對Fn、HUVEC

13、的粘附能力和遷移、侵襲能力。Fn的主要受體是整聯(lián)蛋白α5β1，我們進一步研究EGF的MAPK信號通路對Dul45細胞中整聯(lián)蛋白α5和βl表達的影響。細胞經(jīng)EGF及其EGF+MAPK信號通路抑制劑PD98059分別處理，流式細胞儀檢測及Western-blot檢測顯示整聯(lián)蛋白α5的表達沒有發(fā)生明顯改變，但EGF處理使整聯(lián)蛋白α5β1中β1亞基蛋白的表達顯著增加而EGF+MAPK信號通路抑制劑PD98059后可使Dul45細胞中整聯(lián)蛋白α5