全反式維甲酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的黏附、增殖與遷移是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。其中VSMC的黏附是介導(dǎo)其增殖和遷移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)維持細(xì)胞的生存和正常血管壁結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的衍生物，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化和凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察ATRA對(duì)體外培養(yǎng)的VSMC黏

2、附以及相關(guān)黏附分子表達(dá)的影響，試圖揭示ATRA抑制增殖誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。 方法： 1.VSMC的培養(yǎng)及ATRA處理 1.1 VSMC的培養(yǎng)：取5周齡SD大鼠胸腹主動(dòng)脈，按貼塊法分離培養(yǎng)VSMC。每隔3 d換液一次，至細(xì)胞呈單層匯合后，以0.25％胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。傳代培養(yǎng)的VSMC生長(zhǎng)到70～80％匯合時(shí)，給予全反式維甲酸刺激。 1.2 ATRA處理：用10μM的ATRA分別處理

3、VSMC 0，24，48 h，確定ATRA的時(shí)效關(guān)系。分別用0，5，10μM.ATRA處理VSMC 48 h，確定ATRA的量效關(guān)系。 2.VSMC黏附試驗(yàn)取3～6代的VSMC，血清饑餓使細(xì)胞同步化于靜止期。按照分組給予不同時(shí)間劑量ATRA刺激。然后，將VSMC用胰蛋白酶消化，接種于96孔板在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)取出孔板，用4％多聚甲醛室溫固定，光鏡下觀察黏附的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。隨后用甲苯胺藍(lán)染色，裂解細(xì)胞后，于λ595 nm測(cè)吸光度值，計(jì)算

4、細(xì)胞黏附活性。 3 VSMC黏附分子的表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞間黏附分子-1(vascular cellularadhesion molecule-1，VCAM-1)是VSMC正常表達(dá)的黏附分子，在VSMC黏附中起重要作用。按照分組給予體外培養(yǎng)的VSMC不同劑量、時(shí)間的ATRA刺激，使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和Western Bolt觀察兩種蛋白的表

5、達(dá)變化；用Trizol一步法提取各組VSMC的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)半定量RT-PCR觀察基因的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果： 1.不同時(shí)間、劑量ATRA對(duì)VSMC黏附的影響將ATRA預(yù)處理的VSMC接種于96孔板，置于37℃一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞貼壁情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，ATRA能夠降低VSMC的黏附能力，給予終濃度10μM ATRA后，與對(duì)照組相比，24 h組和48 h組VSMC黏附數(shù)量隨ATRA預(yù)處理的延長(zhǎng)均較對(duì)照組有所下降，

6、分別為對(duì)照組的85.8％(P>0.05)和35.3％(P<0.05)；用不同濃度(5，10μM)ATRA處理VSMC 48 h后，5μM組和10μM組VSMC黏附數(shù)量隨劑量增加均較對(duì)照組有所下降，分別為對(duì)照組的59.1％和34.7％(P<0.05)。同樣條件下，甲苯胺藍(lán)染色試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析與細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果一致。 2.不同時(shí)間、劑量ATRA對(duì)VSMC黏附分子表達(dá)水平的影響免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，在未經(jīng)ATRA處理的VSMC中，I

7、CAM-1和VCAM-1染色為棕褐色顆粒，著色較深，均勻分布于細(xì)胞表面。ATRA預(yù)處理的VSMC中ICAM-1、VCAM-1蛋白陽(yáng)性著色顆粒減少。給予終濃度10μM ATRA刺激后，與0 h組相比，24 h組和48 h組VSMC細(xì)胞膜表面ICAM-1、VCAM-1染色明顯變淺；給予不同劑量ATRA刺激48 h后，5μM組和10μM組VSMC的ICAM-1、VCAM-1表達(dá)量較未處理組明顯減少。 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，ATR

8、A可以下調(diào)VSMC中ICAM-1、VCAM-1基因的轉(zhuǎn)錄活性。給予終濃度10μMATRA刺激后，與0 h組相比，24 h組和48 h組的ICAM-1mRNA水平分別降低了16％和47％；VCAM-1 mRNA水平分別下降了32％和48％。 用不同濃度ATRA處理VSMC后，ICAM-1和VCAM-1mRNA表達(dá)呈劑量依賴性減少，5μM ATRA即可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分別降低50％和 29％；10 μM A

9、TRA可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分別下降54％和51％。 Western Bolt結(jié)果顯示，ATRA能夠抑制ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)。給予終濃度10μM ATRA處理VSMC后，與對(duì)照組相比，24 h組和48 h組的ICAM-1蛋白表達(dá)隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而下降，分別為對(duì)照組的85.8％(P>0.05)和57.6％(P<0.05)；兩組的VCAM-1蛋白表達(dá)亦隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而下降，分別為0 h組的80.1％

10、(P>0.05)和63.6％(P<0.05)。 與RT-PCR結(jié)果相似，5μM組和10μM組ICAM-1蛋白表達(dá)隨劑量增加逐步下降，分別為0μM組的52.9％和46.4％(P<0.05)；VCAM-1蛋白表達(dá)亦隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，分別為對(duì)照組的50.6％和44.6％(P<0.05)。 結(jié)論： 1.ATRA可抑制VSMC的黏附活性，其抑制效應(yīng)呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。 2.ATRA可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，以劑