血清精氨酸代琥珀酸裂解酶活性速率法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、肝病為威脅人類健康的主要疾病之一，中國是肝病大國，肝癌是中國惡性腫瘤的第二號(hào)“殺手”。全世界每年新增約100萬肝癌患者，其中一半發(fā)生在中國。單就乙型肝炎而言，全球有三億多感染者，中國則有一億五千萬之多，近全球一半，占我國總?cè)丝诘?％以上，其中有1/4是慢性乙型肝炎患者，大約是三千余萬，不少因未能診斷出而長期隱匿在正常人群中，嚴(yán)重影響患者本人的生活質(zhì)量和他人的身體健康?？梢姼尾?duì)人類的危害，已成為亟待解決的問題。 肝病早期患者多以

2、肝細(xì)胞不同程度損傷為主，缺乏明顯的臨床癥狀、體征及影像學(xué)改變。因此，肝病的早期主要依靠實(shí)驗(yàn)診斷，血清酶學(xué)檢查是其首選指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，至今已研究探討用于臨床診斷肝臟疾病的酶學(xué)指標(biāo)已有幾十種，但大多數(shù)均因種種原因未被臨床醫(yī)生接受。目前用作反映肝細(xì)胞損傷的血清酶，仍主要是丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)。然而，在長期

3、實(shí)踐中臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者均認(rèn)識(shí)到，在診斷肝病上，ALT和AST的靈敏度尤其是特異性并不令人滿意。鑒于此，尋找一種特異性和靈敏度更好的血清標(biāo)志酶，準(zhǔn)確反應(yīng)肝細(xì)胞損傷，有其重要臨床實(shí)用價(jià)值，也有其學(xué)術(shù)意義。 人體內(nèi)的尿素幾乎全部在肝細(xì)胞內(nèi)生成，精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL；EC4.3.2.1)是肝臟合成尿素重要酶之一。ASL主要分布在肝細(xì)胞漿中，小腸和腎組織含量少，而心、肺、脾等

4、組織僅微量分布，肌肉組織幾乎無此酶活性，故其肝細(xì)胞分布特異性較高，是一個(gè)很有希望成為反映肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志。還有研究表明，ASL是自身免疫性肝病中的一種新的自身抗原，其相應(yīng)自身抗體是一種高度肝特異性自身抗體，不存在于肝外其他自身免疫性疾病患者的血清或體液中。由此可見，血清ASL可望成為肝細(xì)胞損傷的理想標(biāo)志物。本研究從分離純化(Separation and Purification，S&P)人肝組織ASL著手，分3部分較系統(tǒng)地對(duì)人ASL在組

5、織器官中的分布特點(diǎn)、建立自動(dòng)生化分析儀測定血清ASL速率法及方法學(xué)評(píng)價(jià)，以及臨床診斷肝病的性能進(jìn)行研究。 第一部分 目的:探討ASL在人體內(nèi)主要臟器及組織的分布特點(diǎn)，分離純化肝細(xì)胞中ASL。 方法:制備入主要的器官或組織勻漿，分別測定各類勻漿中的ASL活性和蛋白濃度，計(jì)算其比活性(U/g蛋白)；離子交換層析法分離純化肝細(xì)胞ASL，并以SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物。 結(jié)果:在研究的人體器官組織中，肝細(xì)胞AS

6、L比活性最高(3.94 U/g蛋白)，腎臟次之，約為肝的1/10，腦、心、腸、胰、肺中有少量ASL活性，而其他組織、器官僅微量ASL存在。離子交換層析和透析純化的產(chǎn)物，電泳僅見單一條帶，其分子量約50 kD。 結(jié)論:證實(shí)了ASL在人體內(nèi)主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，有相對(duì)高的肝細(xì)胞分布特異性。 第二部分 目的:建立適用于自動(dòng)生化分析儀的ASL活性速率測定法，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 方法:根據(jù)ASL催化的化學(xué)反應(yīng)，以及自

7、動(dòng)生化分析儀工作特點(diǎn)，建立特異性的偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系，以正交試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件。按國際臨床化學(xué)學(xué)會(huì)(IFCC)的有關(guān)文件，對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，包括精密度、回收率、試劑穩(wěn)定性、最低檢測限、線性范圍、干擾試驗(yàn)等。 結(jié)果:建立了一種新的基于酶偶聯(lián)反應(yīng)，以NAD<'+>-NADH為指示系統(tǒng)，可在全自動(dòng)生化分析儀上測定血清ASL活性的動(dòng)力學(xué)方法。確定了該法的最適底物濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件。方法學(xué)評(píng)價(jià)研究表明，本法的精

8、密度：批內(nèi)變異系數(shù)均值為4.0％(3.6％～7％)，批間變異系數(shù)均值為5.9％(4.0％～8.5％)，回收率是100.5％(93.3％～107.2％)，在0～167.7 U/L間有良好的線性范圍，最低檢測限為0 U/L。干擾試驗(yàn)提示：膽紅素<342μmol/L不會(huì)，草酸鈉、K<,2>EDTA、Na<,2>EDTA、檸檬酸鈉、肝素鋰和肝素鈉抗凝劑在抗凝濃度內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生干擾，Hb>0.06g/L時(shí)產(chǎn)生明顯干擾。試劑貯存于2～8℃，20周內(nèi)穩(wěn)定

9、。 結(jié)論:成功建立了適用于自動(dòng)生化分析儀完成的ASL活性速率測定法，該法具有檢測速度快、線性范圍較寬、樣本用量小、特異性和敏感性較高，完全適合臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的特點(diǎn)。 第三部分 目的:應(yīng)用建立的ASL活性自動(dòng)分析方法，探討血清ASL活性測定對(duì)常見的各種肝病的臨床診斷性能。 方法:對(duì)291例肝病患者，包括31例急性肝病患者、165例慢性肝病患者(慢性乙肝患者73例、慢性丙肝患者39例、酒精性肝炎患者25例、藥

10、物性肝炎患者16例和自身免疫性肝炎患者12例)、肝硬化患者67例、肝癌患者28例；排除了肝病的其他疾病患者247例，健康人32例，分別采集血樣制備血清。測定血清ASL和傳統(tǒng)的肝病酶學(xué)指標(biāo)ALT、AST、GGT、LDH及ALP活性，以及TBil水平。慢性肝病組還測定了胱抑素C(cystatin C，CysC)和金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors of metallloproteinases，TIMPs)濃度。肝病組中

11、31例患者進(jìn)行了肝臟病理組織學(xué)檢查。按循證檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)原則，對(duì)上述指標(biāo)的診斷性能進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。對(duì)4例不同肝病患者進(jìn)行了追蹤觀察。 結(jié)果:方差分析顯示，非肝病疾病組ASL活性與對(duì)照組無顯著改變(F=1.108，P=0.355)。而其他肝病酶學(xué)指標(biāo)及總膽紅素與對(duì)照組比較，均有顯著差異(均P<0.05或P<0.01)。與健康對(duì)照相比較，ASL活性在各類肝病患者均有19倍以上的升高，活性范圍與健康對(duì)照組完全無重疊；而ALT和AST除在急性肝

12、炎組分別有25、19倍的升高外，其他肝病組僅有1.5～4倍增加，活性范圍與健康對(duì)照組存在部分重疊。ASL升高的程度依次是肝癌>急性肝炎>肝硬化>慢性肝炎。慢性肝病組ASL活性與非肝病組及健康對(duì)照之間完全無重疊。但ALT和AST則有較大重疊。接收者操作特征曲線(ROC曲線)顯示，ASL(以8 U/L為分界值)對(duì)診斷肝病總的敏感度為99.7％，特異性為97.8％；ALT和AST則分別為97.6％和33.3％，83.8％和36.5％。ROC曲

13、線下面積(95％可信限)ASL為1.000(0.999～1.000、)；ALT和AST(均以40 U/L為分界值)則分別為0.755(0.716～0.793)和0.686(0.643～0.729)。對(duì)診斷慢性肝病，ASL的敏感度為99.4％，特異性為97.8％，曲線下面積約為1.00(0.999～1.000)；而ALT敏感度為63.6％，特異性為34.1％；AST敏感度為61.8％，特異性為37.3％。曲線下面積ALT和AST分別僅是0

14、.556(0.498～0.631)和0.545(0.488～0.602)。與肝病理組織學(xué)檢查結(jié)果相關(guān)性分析表明，ASL濃度(86.9±26.5)與炎癥活動(dòng)度計(jì)分(9.83±3.36)呈正相關(guān)(r=0.417，P=0.019)。Person相關(guān)分析顯示，ASL與CysC和TIMPs在肝纖維化患者中均呈正相關(guān)。追蹤觀察發(fā)現(xiàn)，血清ASL活性的變化，與不同肝病的病理變化進(jìn)程及病毒性肝炎的感染程度相關(guān)。 結(jié)論:血清 ASL活性是反映肝細(xì)胞