精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、研究背景:
　　肝細胞癌（Hepatocellular carcinama，HCC）是全球范圍內(nèi)對人們的健康威脅最大的惡性腫瘤之一，嚴重危害著人們的健康[1]。每年原發(fā)性肝癌的發(fā)病率在惡性腫瘤發(fā)病率中排第5位，男性病死率更是居于第2位[2]。在世界范圍內(nèi)，每年的增加的肝癌患者中，男性患者為530,000例，女性患者為230,000例，分別在癌癥位增加率的第4位和第8位，而每年由于肝癌而死亡的人群中男性為460,000例，女性為21

2、1,600例[3]。過去10年中，我國的原發(fā)性肝癌的發(fā)病率持續(xù)升高，且速度驚人。隨著社會的快速發(fā)展，人口結構和生活方式發(fā)生了巨大的改變，在城市，尤其是大中型城市，原發(fā)性肝癌已經(jīng)位列惡性腫瘤死亡率第2位。盡管隨著醫(yī)療技術的發(fā)展以及人們對 HCC認識的不斷深入，如肝移植，手術切除等等，但原發(fā)性肝癌患者的3年生存率仍未明顯提高。就目前來說，如何早期診斷以及控制術后復發(fā)的仍是HCC研究的重中之重?，F(xiàn)以證實肝癌是由于一系列分子和信號通路紊亂而造成

3、的。因此，找到有效的作用靶點和探索肝癌的發(fā)生機制已成為治療原發(fā)性肝癌的重點和難點。
　　肝臟在代謝、解毒和排泄等方面發(fā)揮重要作用，當發(fā)生肝癌，肝硬化時，機體內(nèi)正常的生理反應會受到影響。血氨在臨床工作中具有重要意義，可用于肝性腦病的診斷和鑒別，正常人血氨為18~72μmol/L。正常人體內(nèi)的氨主要在肝臟中合成尿素，然后經(jīng)腎臟排除體外[4]。在腦、心肌和骨骼肌等組織中，谷氨與谷氨酸在氨酰胺合成酶（glutamine synthetas

4、e, GS）的作用下，生成谷氨酰胺，后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)運至肝臟中，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶（glutaminase）的作用下重新生成氨，最后合成尿素[5]。尿素循環(huán)（urea cycle）是哺乳動物代謝氨一個途徑。首先，在肝細胞的胞漿中，氨基酸與α-酮戊二酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成谷氨酸，并進入線粒體基質(zhì)，經(jīng)谷氨酸脫氫酶催化后生成的一分子的氨[6]；然后，氨基甲酰合成酶I催化游離的氨與CO2、2分子ATP，生成氨基甲酰磷酸，氨基甲酰磷酸在鳥

5、氨酸轉(zhuǎn)氨基轉(zhuǎn)移的催化下生成瓜氨酸[7]；隨后，瓜氨酸進入肝細胞胞漿，在精氨酸代琥珀酸合成酶的催化下，與天冬氨酸縮合成，并消耗一分子 ATP，天冬氨酸在反應中充當氨基供體[8]；最后，精氨酸代琥珀酸裂解生成精氨酸和延胡索酸，而精氨酸被精氨酸酶的催化水解，生成尿素與鳥氨酸[9]。精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS），是一種催化瓜氨酸及天冬氨酸催生成精氨基琥珀酸的酶，反應需要 ATP供能，它是

6、尿素循環(huán)中重要的限速酶[10]。
　　目的:
　　本研究擬采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術將shRNA-ASS1轉(zhuǎn)入SMMC-7721細胞中，沉默ASS1基因，觀察ASS1基因沉默后SMMC-7721細胞的增殖與凋亡情況及其可能的作用機制。
　　材料與方法:
　　1.采用 Real-time PCR和 Western Blot法檢測 ASS1mRNA和蛋白在Changliver、SMMC-7721、HepG2、HepG3B和Q

7、GY-7703細胞中表達差異。
　　2.運用慢病毒轉(zhuǎn)染技術將 shRNA-ASS1轉(zhuǎn)入 SMMC-7721細胞中， Real-time PCR和Western Blot法檢測ASS1mRNA和蛋白的表達情況。
　　3. CCK-8法檢測shRNA-ASS1對SMMC-7721細胞增殖的影響情況
　　4.流式細胞術檢測shRNA-ASS1對SMMC-7721細胞凋亡的影響情況
　　5. Western Blot法檢

8、測shRNA-ASS1對Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表達的影響。
　　6.采用 SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（-X±S）表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用student’s-t檢驗，多組數(shù)據(jù)間的比較用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.與Changliver細胞、HepG2細胞和QGY-7703細胞相比ASS1 mRNA和蛋白在 SMMC-

9、7721細胞和 HepG3B細胞中呈高表達。ASS1 mRNA在SMMC-7721細胞和 HepG3B細胞中的相對表達量明顯高于其他細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ASS1蛋白在SMMC-7721細胞和HepG3B細胞中表達量高于其他細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2. shRNA-ASS1轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細胞較空白對照組SMMC-7721細胞相比， ASS1蛋白水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（ P<

10、0.05）。陰性對照組SMMC-7721細胞空白對照組細胞相比，ASS1蛋白水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明shRNA-ASS1明顯移至SMMC-7721中ASS1基因的表達。
　　3. CCK-8結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA-ASS1細胞生長受到明顯抑制，并與Mock組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Mock組和NC組細胞生長無明顯差別（P>0.05）。
　　4.流式細

11、胞術檢測細胞凋亡結果顯示，空白對照、陰性對照組及shRNA-ASS1組凋亡率分別為(0.3±0.12)％，（3.0±1.08）%和（27.1±3.52）%；與空白對照組相比，shRNA-ASS1組細胞凋亡率明顯上升并且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），空白對照組和陰性對照組細胞生長無明顯差別（P>0.05）。
　　5.轉(zhuǎn)染 shRNA-ASS172h后，ASS-1 shRNA較空白對照組組相比 Bax、Cleaved Caspa