IFN-γ或IP-10培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞和銀屑病皮損的特點(diǎn).pdf

1、銀屑病是一種臨床常見的、原因不明的慢性炎癥性皮膚病。其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是需要多種趨化因子的共同參與，與遺傳的內(nèi)因和外環(huán)境的感染，營(yíng)養(yǎng)，精神狀態(tài)等外因有關(guān)，屬于患者較多自體免疫疾病，且易反復(fù)發(fā)作。目前研究認(rèn)為，銀屑病是與Th1型細(xì)胞相關(guān)的免疫紊亂性疾病。γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)是CXCL家族趨化因子之一，又名CXCL趨化因子配體10，是由IFN-γ所誘導(dǎo)產(chǎn)生的可趨化淋巴細(xì)胞等的分子量為10

2、kDa蛋白質(zhì)。IP-10不僅具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的功能，還能促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子，亦可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增生，能作為趨化因子介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng)。IP-10在銀屑病患者的皮損中表達(dá)持續(xù)上調(diào)，經(jīng)過(guò)成功治療后IP-10表達(dá)減少。IP-10可促進(jìn)銀屑病皮損的發(fā)生及發(fā)展。銀屑病的發(fā)病與IFN-γ有重要關(guān)系，在銀屑病患者的血清及角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度均明顯高于正常人。在皮膚免疫中IFN-γ對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增生與凋亡有

3、重要影響，它促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增生，IFN-γ在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)各種疾病既與基因?qū)W，也與表觀遺傳學(xué)的改變有關(guān)。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)展中起到重要的作用，表觀遺傳學(xué)參與了銀屑病發(fā)病機(jī)制，具體在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中尚不十分清楚。表觀遺傳學(xué)主要包括基因的DNA甲基化;組蛋白的修飾以及小分子RNA調(diào)控。表觀遺傳學(xué)的改變，雖不改變ATCG的序列，卻影響基因的轉(zhuǎn)錄，增殖，分化，凋亡等細(xì)胞過(guò)

4、程。HaCaT細(xì)胞為永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，為研究抗銀屑病藥物活性的常用細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)應(yīng)用IP-10與IFN-γ分別誘導(dǎo)人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞，觀察作用后對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變以及對(duì)增殖與炎癥的影響，并與銀屑病患者皮損組織的病變特征作對(duì)比。初步揭示了IP-10與IFN-γ對(duì)于人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的作用，模擬了銀屑病的皮損組織特點(diǎn)，探討IP-10/IFN-γ對(duì)銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　目的:

5、　　1.觀察IP-10與IFN-γ分別對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)的改變及對(duì)增殖與炎癥的影響。
　　2.銀屑病患者皮損組織與正常組織作對(duì)比，探討銀屑病表觀遺傳學(xué)的改變，對(duì)增殖與炎癥因子的變化。IP-10與IFN-γ分別對(duì)HaCaT的特點(diǎn)與銀屑病皮損相比較，說(shuō)明IP-10/IFN-γ對(duì)銀屑病發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　材料與方法:
　　臨床資料
　　收集我院2011年10月至2012年4月皮膚門診尋常性銀屑病

6、患者皮損20例，均經(jīng)組織病理學(xué)確診。以及收集我院2012年1月至2月泌尿外科包皮切除患者20例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。
　　角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT株凍存于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)研究中心
　　方法
　　實(shí)驗(yàn)標(biāo)本分為細(xì)胞與組織兩大組
　　1)細(xì)胞:IP-10（20ng/ml）組;IFN-γ(50u/L)組及對(duì)照(C)組
　　2)組織:銀屑病皮損組和正常對(duì)照組
　　1.免疫

7、印跡
　　1)細(xì)胞
　　應(yīng)用CelLyticTM提取蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，對(duì)DNMT1，NF-κBp65，HDAC1，CyclinD1，IL-6及P16（以β-actin作為內(nèi)參照）進(jìn)行免疫印跡定性及半定量檢測(cè)。
　　2)組織
　　用勻漿器將組織研碎，應(yīng)用CelLyticTM提取蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，對(duì)DNMT

8、1，NF-κBp65，HDAC1，CyclinD1，IL-6及P16（以β-actin作為內(nèi)參照）進(jìn)行免疫印跡定性及半定量檢測(cè)。
　　2.免疫化學(xué)染色
　　1)細(xì)胞
　　各標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛中固定，吹干及透化，應(yīng)用SP試劑盒，檢測(cè)NF-κB及IL-6的表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行以PBS替代一抗的陰性對(duì)照。
　　2)組織
　　各組織標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛中固定，按常規(guī)脫水、透明并行石蠟包埋切片。在石蠟入水過(guò)程中，用0.3％H

9、2O2處理以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(HRP)，用5mM左旋咪唑處理以抑制外源性堿性磷酸酶(AP)后，應(yīng)用NF-κB鼠單抗，IL-6兔多抗對(duì)皮損組及正常對(duì)照組進(jìn)行以NF-κB，IL-6以AEC酶為底物的免疫組織化學(xué)染色。正常血清封閉，4℃孵育過(guò)夜，先進(jìn)行AEC染色后，再進(jìn)行多抗的NBT-BCIP染色，DAB顯色并終止。同時(shí)進(jìn)行以PBS替代一抗的陰性對(duì)照。
　　3.MSP甲基化特異PCR
　　應(yīng)用TIANampGenomicDNA

10、Kit進(jìn)行各細(xì)胞及組織標(biāo)本的基因組DNA的提取。然后應(yīng)用MethylampTMDNAModificationKit進(jìn)行各基因組DNA甲基化。甲基化特異的p16基因引物及未甲基化特異性的p16基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。DNA電泳檢測(cè)目的產(chǎn)物。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用圖像分析儀掃描各圖像的條帶灰度，各細(xì)胞與組織化學(xué)染色及MSP條帶的信號(hào)值，各免疫印跡數(shù)值為各主帶掃描灰度均值與其各β

11、-actin掃描灰度均值的比值。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，以單因素方差進(jìn)行分析比較，α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫印跡
　　1)細(xì)胞
　　與對(duì)照組相比，DNMT1(180kDa)，NF-κBp65(65kDa)，HDAC1(60kDa)，CyclinD1(36kDa)，IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信號(hào)。IP-10組、IFN-γ組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

12、P＜0.05)。
　　2)組織
　　與對(duì)照組相比，DNMT1(180kDa)，NF-κBp65(65kDa)，HDAC1(60kDa)，CyclinD1(36kDa)，IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信號(hào)。銀屑病患者皮損組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.免疫染色
　　1)細(xì)胞
　　與對(duì)照組相比，IP-10組的NF-κB和IL-6胞核陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng)，差異顯著（P＜0.01）。IF

13、N-γ組的NF-κB和IL-6胞核陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2)組織
　　與正常組織相比，皮損組織表皮增殖旺盛，棘細(xì)胞體積增大，層次增多，可見胞核呈陽(yáng)性信號(hào);皮損組NF-κB與IL-6的表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.01)。
　　3.MSP
　　1)細(xì)胞
　　與對(duì)照組相比，IP-10組、IFN-γ組的甲基化P16表達(dá)較高，非甲基化P16表達(dá)較低，差異具有顯著性P＜0.05）。

14、r>　　2)組織
　　與正常組織相比，銀屑病皮損組織甲基化P16表達(dá)較高，非甲基化P16表達(dá)較低，差異具有顯著性P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.免疫印跡顯示DNMT1和HDAC1在IP-10/IFN-γ細(xì)胞組和皮損組織的表達(dá)均高于相應(yīng)對(duì)照組，提示IP-10/IFN-γ細(xì)胞組和皮損組織皆可能存在表觀遺傳學(xué)的改變。
　　2.IP-10/IFN-γ細(xì)胞組與銀屑病皮損組織中，CyclinD1，NF-κBp65和IL

15、-6的免疫印跡及免疫染色的表達(dá)均顯著增高，并且P16免疫印跡信號(hào)下調(diào)，提示IP-10/IFN-γ誘導(dǎo)了細(xì)胞的增殖與炎癥反應(yīng)。
　　3.MSP顯示IP-10/IFN-γ細(xì)胞組與銀屑病皮損組織中的P16甲基化水平皆高于相應(yīng)對(duì)照組，而非甲基化則明顯下降，低于甲基化。
　　4.IP-10與IFN-γ通過(guò)表觀遺傳學(xué)的改變，顯著提高HaCaT細(xì)胞的增殖及炎癥因子，此與銀屑病皮損組織特點(diǎn)類似。提示IP-10與IFN-γ參與了銀屑病的發(fā)生機(jī)