2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、[目的]:
  通過前期的黃皮果單體化合物的提取制備以及其有效成分結構鑒定,采用H2O2氧化損傷PC12細胞模型篩選10種黃皮果單體化合物的抗氧化損傷活性成分,考察黃皮果活性單體對H2O2引起的PC12細胞凋亡及相關藥理學指標的影響,并探討黃皮果有效成分對神經(jīng)細胞氧化損傷的保護作用和機制。
  [方法]:
  首先,培養(yǎng)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12),H2O2(100μmol/L,2小時)誘導損傷建立細胞氧化損傷模型

2、,再檢測PC12細胞的存活能力,對10種黃皮果單體化合物抗細胞氧化損傷的效價進行評價,篩選表現(xiàn)抗氧化損傷的有效活性單體,則通過Rhodamine123熒光探針檢測細胞內線粒體膜電位(△Ψm)的變化、DCFH-DA檢測細胞內活性氧(ROS)的生成和AnnexinⅤ熒光探針檢測PC12細胞凋亡指標來分析探討黃皮果活性單體對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用;進一步用Western Blot法檢測PC12細胞內caspase-3.NF

3、-kB,Bax,Bcl-2相關蛋白的表達,初步確定黃皮果活性單體對氧化損傷的PC12細胞保護作用的機制。
  [結果]:
  通過H2O2誘導PC12細胞損傷模型初步篩選具有神經(jīng)保護活性單體成分,從10種黃皮果單體化合物成分中評價篩選發(fā)現(xiàn)1種具有神經(jīng)保護活性的單體:槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷,槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷各濃度組能提高H2O2誘導PC12細胞損傷模型存活率,其中作用2個小時25μg/ml的槲皮素-3

4、-O-β-L-葡萄糖苷組提高細胞存活率19.386%(P<0.05),比25μg/ml木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷(3)15.39%、6'-O-硬脂酰-β-D-葡糖基-β-谷甾醇(15)13.63%和正廿六碳烷-1-醇(19)17.53%都高,而有6種黃皮果單體化合物對PC12細胞有損傷作用:7-[(Z)-3,4-二羥基-3-苯基丙烯酰-秦皮乙素(6)(25μg/ml)在24h的細胞存活率為64.66%;6,7-二羥基-2 H-

5、丙氧基-酮(8)(25μg/ml)在24h的細胞存活率為93.00%;蘆丁(1)(25μg/ml)在48h的細胞存活率為77.17%;(Z)-3-(4-羥苯基)丙烯酸(10μg/ml、25μg/ml)在24h的細胞存活率分別為91.09%,89.09%,十六碳酰氯-1-醇(20)(25μg/ml)在24h的細胞存活率為73.56%;胡蘿卜苷(14)(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)在24h的細胞存活率分別為56.04%、5

6、1.87%、50.70%,可以看出7-[(Z)-3,4-二羥基-3-苯基丙烯酰-秦皮乙素(6)、6,7-二羥基-2H-丙氧基-酮(8)、(Z)-3-(4-羥苯基)丙烯酸(10)、十六碳酰氯-1-醇(20)、胡蘿卜苷(14)的細胞存活率在24h或者48h都低于正常組(P<0.01),特別在25ug/ml劑量時對PC12細胞有毒性。
  在此基礎上探討槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷神經(jīng)保護作用及其作用機制。發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L

7、-葡萄糖苷抑制H2O2導致的活性氧族物質的產生(reactiveoxygenspecies,ROS),且呈現(xiàn)出劑量依賴關系?;钚匝?ROS)染色結果顯示:模型組的熒光強度比較強,高于正常組的熒光強度(P<0.05),加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的熒光強度均低于模型組(P<0.05)。加藥組隨著濃度的增加,熒光強度逐漸變弱;DCFH-DA熒光探針流式結果顯示:正常組的活性氧水平為10.5%,模型組的活性氧水平為8

8、0.4%,加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的活性氧水平分別為64.6%、56.2%、52.8%。加藥組隨著濃度的增加,活性氧水平逐漸下降;
  Rhodamine123探針檢測結果顯示,槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷可以抑制H2O2誘導的神經(jīng)元線粒體膜電位降低,且呈現(xiàn)出劑量依賴關系:模型組的熒光強度比較暗,低于正常組的熒光強度(P<0.05),表明H2O2可降低PC12細胞的△Ψm,加藥組(4μg/ml、1

9、0μg/ml、25μg/ml)的熒光強度均強于模型組(P<0.05)。加藥組隨著濃度的增加,熒光強度逐漸增強;在AnnexinⅤ染色熒光中觀察到,槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制H2O2導致的凋亡,且呈現(xiàn)出劑量依賴關系:模型組的熒光強度比較亮,高于正常組的熒光強度(P<0.05),加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的熒光強度均低于模型組(P<0.05)。加藥組隨著濃度的增加,熒光強度逐漸變弱;進一步用Wester

10、n blot檢測相關信號轉導通路蛋白發(fā)現(xiàn):槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制受H2O2誘導損傷的PC12細胞的caspase-3活性升高,Westem blot檢測結果顯示:與正常組相比,模型組的Caspase-3表達量比較高(P<0.05),加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的Caspase-3蛋白的表達量均低于模型組(P<0.05),加藥組隨著濃度的增加蛋白表達逐漸下降;而且,槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑

11、制受H2O2誘導損傷的PC12細胞的Bax/Bcl-2比率的升高,與正常組相比,模型組的Bax/Bcl-2蛋白表達量比較高(P<0.05),加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的Bax/Bcl-2比率均低于模型組(P<0.05),加藥組隨著濃度的增加蛋白表達逐漸下降。
  此外,實驗還發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制受H2O2誘導損傷的PC12細胞的NF-κBp65活性升高,且呈現(xiàn)出劑量依賴關系,West

12、em blot檢測結果顯示:與正常組相比,模型組的NF-κBp65表達量比較高(P<0.05),加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的NF-κBp65蛋白的表達量均低于模型組(P<0.05),加藥組隨著濃度的增加蛋白表達逐漸下降。
  [結論]:
  1.通過實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷可以明顯抗氧化損傷和減少細胞凋亡,且呈現(xiàn)出劑量依賴關系。即抑制氧化應激反應(oxidativestress)和

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