唐氏綜合癥產(chǎn)前分子診斷研究.pdf

1、唐氏綜合癥（Down Syndrome，DS）是活產(chǎn)胎兒中最常見的染色體異常綜合癥之一，其發(fā)病率約為1/650～1/1000?；純和ǔ＞哂袊乐氐闹橇Πl(fā)育遲緩和特別明顯的組織器官畸形。目前其臨床診斷和產(chǎn)前診斷通常采用外周血淋巴細胞和羊水中胎兒細胞培養(yǎng)后的染色體顯帶檢查，該方法耗時長、勞動強度大、通量低。本研究的目的在于建立唐氏綜合癥基因診斷和產(chǎn)前診斷的雙色熒光定量PCR新技術，以實現(xiàn)快速、簡便、高通量檢測這一發(fā)病高、危害大的染色體異常綜合

2、癥。本研究的主要目的是探討應用21號染色體上基因進行DS基因產(chǎn)前基因診斷的可行性與實用性，為建立一種適合臨床應用并且穩(wěn)定、準確、簡便、快速的基因診斷DS的方法提供實驗依據(jù)。收集唐氏綜合癥患者10例和正常人5例的外周血標本，以及進行產(chǎn)前唐氏綜合癥篩查而進行羊水穿刺診斷的羊水標本56例，提取其的外周血淋巴細胞和羊水中胎兒細胞DNA；設計合成分別含不同種熒光素的淀粉樣前體蛋白基因（β-amyloid precuser protein，APP）

3、和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）特異的TaqMan探針，然后優(yōu)化PCR反應條件，在同一個反應管中同時進行APP基因和看家基因hTERT的熒光定量PCR反應，并使得兩者的反應效率基本一致，每個樣本重復三次，比較正常人群和患者群體兩個基因的△CT的變異范圍，對兩組人的△CT做統(tǒng)計學分析，觀察兩者的△CT均值是否有統(tǒng)計學意義。并應用熒光原位雜交技術檢測外周血淋巴

4、細胞和羊水中胎兒細胞培養(yǎng)后的染色體核型分析的結(jié)果相互印證；用熒光定量PCR可以檢測唐氏綜合癥結(jié)果表明：正常人群和患者的APP基因和hTERT基因的APP/ hTERT的比值分別為1.16±0.10和1.64±0.08，有統(tǒng)計學意義上的差異（p<0.001）；本研究建立的雙色實時熒光定量PCR能夠正確區(qū)分DS胎兒和正常胎兒的APP基因劑量，是唐氏綜合癥的一個可行的快速、準確、高通量、費用較為低廉的檢測方法。進一步擴大樣本量，得出準確的變異

5、范圍后，該法可以應用到唐氏綜合癥的診斷和產(chǎn)前診斷中。 為了檢測孕婦外周血和尿中游離胎兒DNA，探討應用孕婦血漿和血清中胎兒DNA對DS產(chǎn)前診斷的可能性。我們收集了35例孕婦的血漿和尿液標本，利用巢式PCR擴增胎兒Y染色體特異序列。在產(chǎn)后確證的20例懷男胎的孕婦中，血漿中Y染色體特異性序列的檢出率為55％，尿液中的檢出率為40％；在15例懷女胎的孕婦中，血漿中的假陽性率為7％，尿液中為14％。研究不同孕期對檢出率的影響時發(fā)現(xiàn)，妊娠

6、早、中、晚期懷男胎的孕婦血漿標本中檢出率無明顯的差異。 產(chǎn)前診斷技術的迅速發(fā)展，為降低遺傳病患者的發(fā)生率，起了非常重要的作用。產(chǎn)前染色體或基因診斷避免了用傳統(tǒng)生化檢驗篩查遺傳疾病費時、費力、敏感度低、準確性差的弊端，成為遺傳疾病產(chǎn)前診斷的有效方法。但是目前的技術存在準確性不高，費用過高，普及不廣的問題。產(chǎn)前診斷技術正從有創(chuàng)性向無創(chuàng)或微創(chuàng)性方向發(fā)展，并盡可能在早期妊娠時確診疾病，及時實施人工流產(chǎn)，可減輕孕婦痛苦，同時降低因取材所致