沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，研究尾靜脈注射WJ-MSCs對(duì)AD的保護(hù)作用及其作用機(jī)制;WJ-MSCs與脾淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)3天，研究WJ-MSCs是否可以在體外調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和/或功能;利用WJ-MSCs與自體小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞心內(nèi)注射移植至APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，研究其對(duì)APP/PS1小鼠的作用及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.為明確WJ

2、-MSCs對(duì)AD動(dòng)物模型的作用及其作用機(jī)制，取足月剖宮產(chǎn)胎兒的臍帶組織，分離得到WJ-MSCs后傳代擴(kuò)增。用6月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，分為對(duì)照組和WJ-MSCs治療組。WJ-MSCs組給予2×106/200ul個(gè)WJ-MSCs尾靜脈注射，對(duì)照組給予200ulPBS尾靜脈注射。3周后利用Morris水迷宮進(jìn)行小鼠的行為學(xué)測(cè)試，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期）檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)能力，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的記

3、憶能力。治療后4周采用硫磺素S染色法，檢測(cè)小鼠腦冰凍切片老年斑的沉積，并采用Elisa法定量檢測(cè)腦內(nèi)可溶性的Aβ40及Aβ42水平。在治療后的第1天和4周采用ELISA法檢測(cè)血清和腦內(nèi)抗炎因子IL-10含量;采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1的含量;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠腦中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，并采用ELISA法檢測(cè)小鼠腦中IL-1β、TNF-α的蛋白含量。
　　2.為明確WJ-M

4、SCs是否可以在體外調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和/或功能，取足月剖宮產(chǎn)胎兒的臍帶組織，分離得到WJ-MSCs后傳代擴(kuò)增。為明確與WJ-MSCs共培養(yǎng)后Tregs是否具有免疫抑制功能，我們把純化的共培養(yǎng)后和未共培養(yǎng)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分別與CFSE標(biāo)記的同種異體脾淋巴細(xì)胞在含有PHA(10ug/ml)培養(yǎng)基中體外共培養(yǎng)3天，用流式細(xì)胞儀和ModFit軟件分析細(xì)胞增殖指數(shù)。
　　3.為明確與WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+

5、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植對(duì)AD動(dòng)物模型的作用及其作用機(jī)制，從與WJ-MSCs共培養(yǎng)后的小鼠脾淋巴細(xì)胞純化的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)心內(nèi)注射至APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(n=15)，首次劑量為0.5×106個(gè)細(xì)胞/100ulPBS。然后一周后以0.2×106個(gè)細(xì)胞/100ulPBS劑量進(jìn)行第二次注射。另一組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(n=15)注射相同劑量PBS作為對(duì)照組。第一次注射3周后，注射CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組

6、(n=15)、PBS組(n=15)的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠利用Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試:觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期）檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)能力，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的記憶能力。在Morris水迷宮試驗(yàn)后，用ELISA法檢測(cè)血清促炎細(xì)胞因子IFN-γ和抗炎細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β1）的水平。第一次注射4周后，采用硫磺素S染色法，檢測(cè)小鼠腦冰凍切片老年斑的沉積，并采用Elisa法定量檢測(cè)腦內(nèi)可溶性的

7、Aβ40及Aβ42水平;使用Iba-1抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞并通過(guò)熒光免疫組織化學(xué)方法分析APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.WJ-MSCs對(duì)AD動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制
　　1.1 WJ-MSCs改善了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　1.2 WJ-MSCs明顯降低了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的沉積和可溶性Aβ的水平。
　　1.3 WJ-M

8、SCs對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　1.3.1 WJ-MSCs增加了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血清及腦內(nèi)抗炎因子IL-10的表達(dá)，抑制了炎癥反應(yīng)。
　　1.3.2 WJ-MSCs抑制促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞激活，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的含量，結(jié)果顯示，尾靜脈注射WJ-MSCs第1天后，小鼠Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較PBS對(duì)照組增加，干預(yù)后4周，WJ-MSCs干預(yù)組Iba-1

9、陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組減少。提示W(wǎng)J-MSCs可能在治療后期抑制了促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞激活。
　　1.3.3 WJ-MSCs顯著降低了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)促炎因子TNF-α和IL-1β的含量，但沒(méi)有改變IL-6的含量。在治療后第1天和4周，與PBS對(duì)照組比較，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示AD小鼠腦中促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平在WJ-MSCs治療組均顯著降低，然而，兩組之間的小鼠腦中IL-6的表達(dá)無(wú)明顯改變。E

10、LISA檢測(cè)的數(shù)據(jù)顯示，與PBS對(duì)照組相比，小鼠腦內(nèi)IL-1β、TNF-α蛋白的含量在WJ-MSCs治療組也顯著降低。
　　2.WJ-MSCs提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和功能
　　2.1 WJ-MSCs提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。WJ-MSCs與脾淋巴細(xì)胞在1∶5的比例（WJ-MSCs:脾淋巴細(xì)胞）體外共培養(yǎng)3天，流式

11、細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，與無(wú)WJ-MSCs共培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞相比，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞亞群中的比例顯著增加。
　　2.2 WJ-MSCs增強(qiáng)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　3.WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植對(duì)AD動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制
　　3.1 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性

12、T細(xì)胞移植改善了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　3.2 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植明顯降低了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的沉積和可溶性Aβ的水平。在第一次心內(nèi)注射4周后，我們采用硫磺素S染色測(cè)量皮層和海馬老年斑沉積面積。結(jié)果顯示，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植后，皮層和海馬的老年斑面積和數(shù)量顯著減少。采用ELISA法定量檢測(cè)腦內(nèi)可溶性的A

13、β40及Aβ42水平，結(jié)果顯示，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞治療能顯著降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ40和Aβ42的含量。以上結(jié)果表明WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植顯著降低了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ水平。
　　3.3 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞移植對(duì)AD動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　3.3.1 WJ

14、-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血清抗炎因子IL-10和TGF-β1的水平，并顯著降低了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血清促炎因子的水平，抑制了炎癥反應(yīng)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，用ELISA法檢測(cè)了血清促炎因子IFN-γ與血清抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的含量，結(jié)果顯示，與接受PBS的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞治

15、療使小鼠血清抗炎細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10的水平都顯著增加，并顯著降低了血清促炎因子IFN-γ的含量。
　　3.3.2 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。第一次心內(nèi)注射4周后，使用Iba-1抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞并通過(guò)熒光免疫組織化學(xué)方法分析APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。我們觀察到，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞治療后大多數(shù)的皮層小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體較小，突起細(xì)

16、長(zhǎng)，而用PBS處理后皮層小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為胞體變大，突起變短，此外，我們發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞治療顯著減少了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)論：
　　1.尾靜脈注射WJ-MSCs能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能，降低小鼠腦內(nèi)老年斑的沉積。
　　2.WJ-MSCs的作用機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，增加了抗炎因子的表達(dá)、降低了促炎因子的表達(dá)和抑制促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　3.WJ-MSCs提高