MicroRNA-1對肝癌細(xì)胞Hep3B凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病率高,致死率高,被稱為“癌中之王”。肝癌的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但目前的研究認(rèn)為異常的細(xì)胞凋亡和肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。肝癌對常規(guī)的放化療敏感度均很低,進(jìn)一步提示在肝癌細(xì)胞內(nèi)可能存在著的一套高效而復(fù)雜的抗凋亡體系。miRNA是一類長度為18-24個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子,通過和靶基因的mRNA非編碼區(qū)結(jié)合從而阻遏蛋白質(zhì)翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解,在轉(zhuǎn)錄后水平達(dá)到基因沉默的效應(yīng)。目

2、前人體大約有60％左右的基因表達(dá)受到 miRNA的調(diào)控。miRNA在腫瘤的生物學(xué)行為中扮演者重要角色。miR-1就是已被廣泛證實(shí)的一個抑癌基因。miR-1在許多實(shí)體瘤中均有表達(dá)的缺失或下調(diào),功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)miR-1對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖,誘導(dǎo)凋亡,減少侵襲的作用。miR-1的作用機(jī)制也非常廣泛,miR-1可以作用于c-met,細(xì)胞周期蛋白(CCND2),轉(zhuǎn)錄因子FoxP1等重要的原癌基因從而在多種實(shí)體瘤中發(fā)揮抑癌效應(yīng)。在miR-1與

3、肝癌的研究方面,有文獻(xiàn)報(bào)道 miR-1能通過調(diào)控內(nèi)皮素-1(ET-1)的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖,也有研究發(fā)現(xiàn)miR-1能靶向抑制肝癌細(xì)胞HepG2中ETS1的表達(dá),而ETS1能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解從而介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。還有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-1能通過作用于轉(zhuǎn)錄因子E2F誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向普通肝細(xì)胞表型分化,但關(guān)于miR-1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。我們擬在肝癌細(xì)胞Hep3B中過表達(dá)miR-1然后觀察其對細(xì)胞凋亡的

4、影響,并在此基礎(chǔ)上尋找可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步理解miR-1對肝癌的抑癌效應(yīng)及探索肝癌治療的策略提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分過表達(dá)miR-1質(zhì)粒對Hep3B細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及凋亡檢測
　　1.構(gòu)建過表達(dá) hsa-miR-1-1基因的真核表達(dá)型質(zhì)粒,按照非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑attractene transfection reagent操作指南將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,并設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對照組(NC)和未行轉(zhuǎn)染的

5、空白對照組(blank)。轉(zhuǎn)染后48h觀察報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 miR-1表達(dá)水平以評估轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況。
　　2.轉(zhuǎn)染48h后用annexin V/PI雙染后行流式細(xì)胞儀分別檢測miR-1組、nc組、blank組細(xì)胞凋亡情況,分析指標(biāo)為早期凋亡(即annexin V陽性/PI陰性)率。
　　第二部分生物信息學(xué)方法分析miR-1下游靶點(diǎn)及其在肝癌中的表達(dá)情況
　　

6、1.使用 targetscan, miRTarBase and PicTar等軟件預(yù)測miR-1的下游靶點(diǎn),并從中篩選和細(xì)胞凋亡功能密切相關(guān)的分子。
　　2.收集臨床切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織及其癌旁組織共16對,Western Blot檢測組織中我們挑選的下游靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)情況。
　　第三部分 miR-1對下游靶點(diǎn)mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響
　　1.將過表達(dá) miR-1的細(xì)胞,nc組細(xì)胞及blank組細(xì)胞提取總RNA

7、后行 RT-qPCR檢測我們挑選的潛在靶點(diǎn)mRNA表達(dá)變化。
　　2.將過表達(dá)miR-1的細(xì)胞,nc組細(xì)胞及blank組細(xì)胞提取總蛋白后行Western Blot檢測其我們挑選的潛在靶點(diǎn)蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分過表達(dá)miR-1質(zhì)粒對Hep3B細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及凋亡檢測
　　1.轉(zhuǎn)染后48h miR-1組和nc組均有大量綠色熒光蛋白表達(dá),提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。將轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞提取總RNA行RT-qPCR結(jié)果

8、顯示轉(zhuǎn)染過表達(dá)目的基因組miR-1的表達(dá)遠(yuǎn)高于 nc組,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示miR-1過表達(dá)成功。
　　2.轉(zhuǎn)染后48h行annexin V/PI雙染及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-1過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞的早期凋亡率為(30.27±2.62)%;轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的 nc組早期凋亡率為(4.13±0.92)%;未行轉(zhuǎn)染的空白對照組細(xì)胞早期凋亡率為(1.91±0.36)%,miR-1組和 nc組的結(jié)果具有明顯的統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　第二部分生物信息學(xué)方法分析miR-1下游靶點(diǎn)及其在肝癌中的表達(dá)情況
　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示BAG4可能是miR-1的下游作用靶點(diǎn)。而BAG4已證實(shí)能通過與細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合從而發(fā)揮抗凋亡作用。
　　2.16對臨床樣本的 western blot結(jié)果顯示:BAG4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯升高,western blot灰度值分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

10、r>　　第三部分 miR-1對下游靶點(diǎn)mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響
　　4.RT-qPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-1質(zhì)粒細(xì)胞的BAG4 mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的nc組細(xì)胞明顯降低,二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　5.western blot結(jié)果顯示細(xì)胞過表達(dá)miR-1后 BAG4蛋白的表達(dá)較nc組和 blank組顯著下降,而nc組和blank組之間無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1. miR-1對