MicroRNA-135a對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】
　　胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是惡性程度最高的腫瘤之一,其中,胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)占90％以上。由于早期臨床癥狀隱匿,診斷困難,絕大部分PDAC患者在確診時(shí)腫瘤已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或侵襲到胰外器官而無法行根治性手術(shù)切除;此外,PDAC對(duì)放療和化療均不敏感,患者的中位生存時(shí)間不到6個(gè)月,5年生存率小于5%,預(yù)后極差。近年來,我國(guó)及西方國(guó)家的

2、PDAC發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展,PDAC的相關(guān)分子生物學(xué)研究對(duì)于闡明PDAC發(fā)病機(jī)制,提高PDAC診治水平,改善患者預(yù)后具有重要意義。
　　MicroRNA(miRNA)是由17～25個(gè)核苷酸所組成的非編碼小分子單鏈RNA,具有高度保守性,通過與靶基因mRNA的3’端的非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合,降解或者抑制mRNA的翻譯,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在許多生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,其

3、異常表達(dá)與多種疾病相關(guān)。在腫瘤研究領(lǐng)域,miRNAs涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展代謝、耐藥等多個(gè)方面,并具有組織特異性,通過調(diào)控眾多腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)揮類似于原癌基因或者抑癌基因的作用。目前,有關(guān)miRNAs在PDAC的研究涵蓋了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等方面。對(duì)比分析PDAC細(xì)胞系、組織樣品、體液及小動(dòng)物模型相對(duì)于正常組的miRNA表達(dá)譜變化,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)譜存在顯著差異,一部分miRNAs的表達(dá)上調(diào),如miR-21,miR-1

4、55,miR-10b,miR-196,miR-221,miR-301,miR-95等,而另一些miRNAs則表達(dá)下調(diào),如miR-217,miR-216,miR-375,miR-203等。這些異常表達(dá)的miRNAs調(diào)控的靶基因有KRAS,PTEN,PDCD4,ZEB1,BCL-2,TIMP3等等。但是現(xiàn)階段的研究仍存在很多尚未闡明的問題,關(guān)于PDAC中miRNAs及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和作用機(jī)制方面還需進(jìn)一步的研究。miR-135a被證

5、實(shí)在許多腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用,但在胰腺癌中的作用尚未見有相關(guān)研究。
　　Bmi1(B-ceIl-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因,屬于多梳基因PcG(polycomb group genes)家族。Bmi1基因在細(xì)胞周期、細(xì)胞永生化和衰老的調(diào)解中發(fā)揮重要作用。近年來,許多研究證實(shí)了Bmi1基因還參與了干細(xì)胞的自我更新

6、和分化。Bmi1基因與腫瘤關(guān)系密切,通常被認(rèn)為是一個(gè)重要的癌基因。肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肝癌和胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展都和Bmi1的異常表達(dá)有關(guān)。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與分析,我們推測(cè)Bmi1基因是miR-135a的潛在靶基因之一。
　　miR-135a是否參與PDAC的發(fā)生和發(fā)展?其在PDAC中的功能是什么?這些功能是否是通過調(diào)控Bmi1來實(shí)現(xiàn)的?因此,miR-135a在PDAC發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

7、r>　　【目的】
　　通過miRNA表達(dá)譜芯片篩選 PDAC細(xì)胞系及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系中發(fā)生差異表達(dá)的miRNA分子,確定研究對(duì)象(即 miR-135a)后探討其在 PDAC發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)功能和機(jī)制,為PDAC的診療尋找新的靶點(diǎn)。
　　【方法】
　　1.本實(shí)驗(yàn)選用高通量的Agilent Human microRNA array kit(V18.0)檢測(cè)3種PDAC細(xì)胞系(PANC-1、BxPC-3和ASPC-1)

8、及1種正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系(HPDE6c7)中的miRNAs表達(dá)情況。并采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)的方法在腫瘤組織及細(xì)胞系中驗(yàn)證部分差異表達(dá)的miRNAs,結(jié)果證明芯片檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠,并且挑選miR-135a作為研究對(duì)象。
　　2.構(gòu)建過表達(dá)miR-135a的慢病毒載體Lenti-miR-135a,轉(zhuǎn)染PDAC細(xì)胞系,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8),克隆形成實(shí)驗(yàn)、EdU細(xì)胞增殖

9、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)及 Matrigel實(shí)驗(yàn)等方法觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、侵襲和遷移的影響。并通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來觀察miR-135a對(duì)PDAC增殖能力的影響。
　　3.miR-135a下游靶基因的預(yù)測(cè)、驗(yàn)證及相關(guān)機(jī)制研究:利用 miRanda、Pita,及 RNAhybrid等靶基因預(yù)測(cè)軟件,結(jié)合相關(guān)因素進(jìn)行分析,篩選出 Bmi1可能為miR-135a的下游靶基因。在PDAC細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-1

10、35a后利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blotting)檢測(cè)Bmi1基因mRNA和蛋白水平的改變。之后采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-135a對(duì)Bmi1的調(diào)控作用。然后,western blotting檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)分子p21,cyclin D1,Cdk2,Cdk4,Akt,pAkt,Bcl-2,Bax的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.Agilent human miRNA芯片檢

11、測(cè)結(jié)果顯示,與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系相比,PDAC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的miRNA有23個(gè)(fold change>2),包括 miR-21,miR-10a-5p,miR-10b-5p和miR-301a-3p等,表達(dá)下調(diào)的有43個(gè)(fold change<0.5),如miR-205-3p,miR-203,miR-630以及miR-135a等。結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道的差異表達(dá)的miRNAs,芯片檢測(cè)結(jié)果可準(zhǔn)確性及可靠性高。通過芯片篩選及查閱相關(guān)文獻(xiàn)

12、,我們發(fā)現(xiàn) miR-135a在肺癌、腎癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達(dá)均有明顯的降低并和細(xì)胞增殖、凋亡等惡性表型相關(guān),但是在PDAC中的表達(dá)變化及其功能未見報(bào)道。所以我們選擇 miR-135a作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。為驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果,我們還采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)miR-135a在PDAC細(xì)胞系及組織中的表達(dá)狀況進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)相較于癌旁正常組織和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系,miR-135a在 PDAC組織和細(xì)胞系的表達(dá)均顯著下調(diào),結(jié)果與芯片結(jié)

13、果相一致。提示miR-135a在 PDAC的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.轉(zhuǎn)染Lenti-miR-135a后,采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力減弱;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成能力減弱;EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力減弱。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增加了G0?G1期細(xì)胞的比例,G2/M

14、期的細(xì)胞的比例下降,并且增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)提示,與對(duì)照組相比,注射轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的裸鼠成瘤能力顯著減弱。Transwell小室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果則提示miR-135a對(duì)PDAC細(xì)胞的遷移與侵襲能力無明顯影響。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示,Bmi1可能是miR-135a作用的靶基因之一,采用western blotting檢測(cè) PDAC細(xì)胞系及組織中的Bmi1基因的蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與miR-135a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。過

15、表達(dá)或抑制 miR-135a對(duì) Bmi1基因的mRNA水平無明顯影響,但卻對(duì)其蛋白水平則呈負(fù)性調(diào)控作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-135a可以抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因的活性,而對(duì)含突變位點(diǎn)的質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒沒有影響。進(jìn)一步驗(yàn)證了生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果。
　　4.western blotting檢測(cè)PDAC細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子p21,cyclin D1,Cdk2,Cdk4的變化。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較,過表達(dá)miR-135a

16、后細(xì)胞中cyclin D1,Cdk2,Cdk4的表達(dá)明顯下調(diào),p21的表達(dá)則上調(diào)。而同時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-135a mimics與pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后,與僅過表達(dá)miR-135a組細(xì)胞相比,上調(diào)了cyclin D1,Cdk2,Cdk4的表達(dá),p21的表達(dá)則下調(diào)。western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比較,過表達(dá)miR-135a后細(xì)胞中phospho-A

17、kt和Bcl-2的表達(dá)受到抑制,Bax表達(dá)水平則升高,同時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-135a mimics與pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后,與僅過表達(dá)miR-135a組細(xì)胞相比,phospho-Akt和Bcl-2表達(dá)升高,Bax的表達(dá)被抑制。
　　【結(jié)論】
　　1.高通量 miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果及實(shí)時(shí)定量 RT-PCR實(shí)驗(yàn)提示 miR-135a在PDAC細(xì)胞系和組織中的表達(dá)較正常胰腺導(dǎo)管上皮