頜骨骨纖維異常增殖癥骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及Gs α基因突變分析.pdf

1、目的:
　　 骨纖維異常增殖癥(fibrous dysplasia of bone,FD),是一種良性骨纖維組織病損。Robey等認(rèn)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)激活型Gsα基因發(fā)生錯義突變是導(dǎo)致FD的原因,FD的治療方法很大程度上依賴于對BMSC生物功能及其如何控制骨再生的研究,因此,從骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并測定其Gsα基因的編碼基因位點進(jìn)行突變分析

2、具有重要理論意義和實際價值。
　　 本實驗以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)探討一種從FD病變標(biāo)本中分離、培養(yǎng)BMSC的有效方法,為研究FD的病因和發(fā)病機制奠定基礎(chǔ),并對骨纖維發(fā)育異常的病因?qū)W作初步研究,探討一種關(guān)于頜骨骨纖維異常增殖癥(FD)患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的Gsct蛋白編碼基因位點突變分析的方法驗證頜骨骨纖維異常增殖癥的基因突變類型。
　　 方法:
　　 1.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

3、頜骨FD患者經(jīng)X線及組織病理學(xué)確診,術(shù)中取組織標(biāo)本將其剪碎后沖洗獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察細(xì)胞的形態(tài),2.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性分析檢測獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)標(biāo)志物并用MTT法測定BMSC細(xì)胞生長曲線。
　　 3.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定將獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化,觀察其細(xì)胞形態(tài),用鈣鈷法檢測堿性磷酸酶活性并用茜素紅染色法檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。

4、>　　 4.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞Gsα基因型分析從獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞提取細(xì)胞DNA,通過定向誘導(dǎo)突變,巢式PCR及限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切等方法將突變基因擴(kuò)增,并進(jìn)行基因序列測定。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代細(xì)胞呈長梭形的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞密集生長處呈現(xiàn)旋渦狀,傳代后細(xì)胞均呈漩渦狀生長,排列整齊,多呈長梭形或多角形,進(jìn)一步純化后,細(xì)胞形態(tài)趨于長梭形。
　　 2.99％的細(xì)胞表達(dá)CD44和HL

5、A-ABC,不表達(dá)CD34.由生長曲線可見:傳代培養(yǎng)的潛伏期為24h,對數(shù)生長期出現(xiàn)在第3-4天,5天后細(xì)胞進(jìn)入平臺期。
　　 3.BMSC細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后,呈現(xiàn)成骨細(xì)胞形態(tài),三角形、多角形,鈣-鈷法行堿性磷酸酶染色,可見大部分細(xì)胞內(nèi)呈陽性反應(yīng),經(jīng)茜素紅染色后可見有形成的鈣結(jié)節(jié)。
　　 4.頜骨FD患者的BMSC中Gsα第201位氨基酸的編碼基因突變G→A或C→T,造成第201位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸或精氨酸突